バイオインフォマティクス中部大学2024年秋学期

PCRを用いた実験の解析

今日、生物学の様々な分野でPCRが用いられている。 PCR法は目的とするDNA断片を効率よく増幅する方法で、DNAの解析には欠かすことができない手法である。

PCR反応の概略

PCRに必要なもの

DNAポリメラーゼ
DNAの合成を行う酵素。第1回の講義で述べたようにDNAポリメラーゼはDNA鎖の伸長だけを行い、合成を開始することができないのでプライマーを必要とする。全てのDNAポリメラーゼは5'から3'の方向にDNA鎖を伸ばしていくことも忘れてはならない。現在市販されているPCR用のDNAポリメラーゼは全て高温耐性で、50から70°Cぐらいで高い酵素活性を示す。
プライマー (オリゴDNA)
DNAポリメラーゼが伸長反応を行う起点となる短い(10から20程度)一本鎖DNA分子。通常は実験の目的に応じて合成を業者に依頼して作成する特注品である。鋳型となるDNAの特定の領域をはさむように設計する必要がある。
鋳型DNA (テンプレート)
増幅したい塩基配列をもつDNA。抽出したDNAやRNAを逆転写して得るcDNAを用いることが多い。 PCRは1分子の鋳型DNAから数百万倍に増幅することができるので、鋳型DNAはごく微量でよい。
バッファー (緩衝液)
DNAポリメラーゼが高い活性を示すために反応液に加える試薬。 DNAポリメラーゼが必要とするMg²⁺、適度な塩濃度、pHを整える働きがある。
dNTP
DNAポリメラーゼの基質となるdATP、dCTP、dGTP、dTTPの4種の化合物の混合溶液。

これらのうち、バッファーとdNTPは使用するDNAポリメラーゼによってほぼ決まっており、工夫の余地は少ない。また鋳型DNAも研究の目的によって決まり、種類を選ぶことはほとんどできない(DNAの抽出方法はDNAの純度やその状態に影響を与えるので検討する余地はある)。

DNAポリメラーゼは様々な性質のものが市販されており、その用途に応じて使い分ける必要がある。例えば増幅したいDNAの長さ(分子量)、鋳型DNAの量、増幅の正確性(DNAポリメラーゼの複製の正確性)に応じて適切なポリメラーゼを選択する必要がある。

プライマーの特異性

プライマーは鋳型DNAの狙った場所に特異的に結合することが重要である。プライマーと鋳型DNAの結合はAとT、CとGの塩基間の水素結合であり、それが多数できることで安定になる。

DNAには4種類の塩基があるので、それらが均等であれば特定の塩基がでてくる確率は4分の1である。 2塩基が連続して一致する確率は(1/4)²であり、3塩基が連続して一致する確率は(1/4)³となる。

ヒトのゲノムサイズが約3Gbp (30億bp)で、それは4¹⁵から4¹⁶の範囲にある。言い換えると16塩基の長さの塩基配列がヒトのDNAの中に偶然存在する確率が約0.7 (= 3e9 / 4¹⁶)である。 20塩基であれば偶然存在する確率は0.27%となり、そういうことはまず起きないと言ってよいレベルである。つまり20塩基程度の長さがあればプライマーが鋳型と結合する場所は1箇所となる。

プライマーを設計するときの留意点

Tm (melting temperature)

塩基対を形成する力は水素結合であり、これは弱い力なので温度が高くなると壊れる。一般にPCR反応では95-98°Cにして二本鎖DNAを変性して一本鎖にし、50–65°Cにしてプライマーと鋳型DNAの結合をつくる。二本鎖DNA解離して一本鎖DNAになる温度をTmと呼ぶ。 Tmは反応液に含まれる各種の塩濃度、pHによって左右されるが、その主因は塩基配列である。

AとTの塩基対では2つ、CとGでは3つの水素結合が形成される。この水素結合を切る温度がTmである。オリゴDNAと鋳型DNAの結合力はこれらの総和となるので、CとGが多いほど結合は強くなり、高温でも安定化する(つまりTmが高い)。逆にAとTが多いとより低温にしないとプライマーと鋳型DNAの結合ができず(つまりTmが低い)、DNAポリメラーゼが働くことができない。

Tmは反応条件によって変化するので、一概に計算することができるものではないが、多くの近似的な解を与える計算方法が知られている。

プライマーダイマー (primer dimer)の形成

プライマーが鋳型と結合せずにプライマー同士で結合して増幅してくるPCR産物をプライマーダイマーと呼ぶ。 PCRの反応液中にはごく少量の鋳型DNAと過剰のプライマーが存在しているため、プライマー同士の結合が起きやすい。特に以下のような塩基配列を持っているとプライマーダイマーができやすいので、プライマーを設計するときには注意する。

プライマー間で相補的な配列

例えば 5'-ATCATCCGAACTAGTGAAGTCATCC-3' と 5'- CCTACTGATCAAGCCTACTAGGATG -3' というプライマーを使用したとすると、以下のような結合を生じる可能性がある。

5'- ATCATCCGAACTAGTGAAGTCATCC -3' -> ポリメラーゼによる伸長反応
                        |||||
                 <- 3'- GTAGGATCATCCGAACTAGTCATCC -5'

このときそれぞれのプライマーは互いを鋳型としてポリメラーゼの反応を起こさせる。元々プライマーは反応液に過剰にあるため鋳型DNAと結合することなくプライマーダイマーの合成に使われ、目的とするDNA断片を得ることができなくなる。

回文(パリンドローム)

例えば 5'-ATCATCCGAACTAGTGAAGGAGCTC-3' というプライマーは3'側に回文構造(相補鎖にしたときに同じ配列になる)があり、これも以下のような結合を生じてプライマーダイマーの形成につながりやすい。

5'- -ATCATCCGAACTAGTGAAGGAGCTC -3' -> ポリメラーゼによる伸長反応
                        ||||||
                 <- 3'- CTCGAGGAAGTGATCAAGCCTACTA -5'

CGが多い配列

CとGの塩基は水素結合が多いために塩基対が形成されやすく、非特異的な二本鎖形成につながりやすい。 CとGの割合は50%以下にしておくほうがよい。

5'- -ATCATCCGAACTAGTGGAGGACCCC -3' -> ポリメラーゼによる伸長反応
                  |||||:::|  
          <- 3'- CCACCTGGAGTCGGATGAT -5'

Tmの計算方法

プライマーのTmの算出には多くの方法があるが、ここでは簡便な2種類の方法を記す。

ATを2°C、CGを4°Cとして合計する

プライマーの塩基配列中のそれぞれの塩基を数え、AとTは2倍、CとGは4倍した合計値をTmとする方法。

例

CGAGCCTGAGGATTTGATTGAT という配列をもつプライマーを考える。これにはAが5個、Tが7個、Cが3個、Gが7個含まれるので、(5 + 7) * 2 + (3 + 7) * 4 = 64 °Cとする。

問題

ATCATCCGAACTAGTGAAGTCATCC という配列のプライマーのTmを計算せよ。

ウェブ上のツールを使用する

Tmを計算してくれるツールはいくつもある。

Oligo Calculator 株式会社日本遺伝子研究所提供
Tm Calculation VitaScientific

問題

ATCATCCGAACTAGTGAAGTCATCC という配列のプライマーのTmを計算せよ。

Excelを使ったGC含量の計算

プライマーの配列の長さを数えるのは面倒であるし、間違いやすい。 CとGの数も同様である。そこでExcelを使って計算してみる。

塩基配列といってもコンピュータの計算上は文字列として扱うことができる。 Excelで文字列の文字を数えるにはlen関数を使うことができる。

特定の文字(この場合CとかG)を数える関数は用意されていないので、工夫が必要である。 substitute関数は文字列中の特定の文字を別の文字に置換することができる。これを使ってCを消すことができる(長さ0の文字に置換する)。置換後の文字列の長さを元の長さと比較することでCを数えることができる。

数式の入力例

絶対参照の利用

計算結果

PCR産物の推定

PCR反応を行ったあと、通常はPCR産物の確認のために電気泳動を行う。その際重要なことは目的とするDNA断片が得られているかどうかの判定で、その大きさが基準となる。

鋳型となるDNAの塩基配列中にプライマーの塩基配列を探すときにはExcelのfind関数を使うことができる。反対側のプライマーも同様に探すことができるが、相補鎖に変換することとfindがみつける位置は常に左側であることに注意する。

             | findの位置
primer_F 5'- ATGGAGAAATACGAGAAATTG -3' : このプライマーの塩基配列は鋳型と一致する
template 5'- ATGGAGAAATACGAGAAATTGGAGAAA---(省略)---ACTTCGATAGCTTGGACAAGTCTCAGTTTTGA -3'
         3'- TACCTCTTTATGCTCTTTAACCTCTTT---(省略)---TGAAGCTATCGAACCTGTTCAGAGTCAAAACT -5'
primer_R                                                     3'- CCTGTTCAGAGTCAAAACT -5' 反対側のプライマーは鋳型の相補鎖と一致することに注意 
                                                                 | findの位置

手順

以下の鋳型DNAの塩基配列をExcelにコピーする。
>NtBYT025674.000 ATGGAGAAATACGAGAAATTGGAGAAAGTAGGAGAAGGAACGTACGGCAAAGTATATAAAGCAAAGGACAAAGCAACGGGTCAATTGGTGGCGCTGAAGAAAACTCGGCTAGAAATGGACGAAGAAGGGATTCCACCCACTGCTTTAAGAGAAATATCACTTCTTCAAATGCTTTCCAATTCTCTCTACATCGTTCGTCTCCTCTGTGTCGAGCAAATTGACAAAAATGGGAAGCCTCTTCTTTACCTAGTTTTTGAGTATTTGGATACTGATCTGAAGAAATTCGTCGATTCTCATCGTAAAGGTCCTAATCCTAGACCTCTCCCTCCTTCTCTCATCCAGAGTTTCTTATATCAATTGTGCAAAGGGGTCGCTCACTGCCATAGCCATGGAGTTCTCCACAGAGATTTGAAGCCACAGAACCTATTAGTGGACAAAGAGAAGGGCATACTTAAGATTGCTGATTTGGGTCTTGGAAGGGCTTTCACTGTCCCAATAAAGAGCTACACCCATGAGATTGTTACTCTATGGTACAGAGCTCCTGAAGTCTTGTTGGGATCTACTCATTACTCAACTGCGGTTGATATGTGGTCTGTGGGATGTATTTTTGCCGAGATGGTTCGAAGGCAGGCCTTATTTCCTGGTGACTCTGAGTTTCAGCAATTGCTTCACATATTCAGGTTGTTAGGAACCCCAACTGAGAAGCAGTGGCCTGGAGTGAGTTCACTCCGCGACTGGCATGTTTATCCAAAATGGGAACCTCAGAACTTGGCCTCTGCTGTTCCAGCATTGGGTCCTGATGGTGTGGATCTCCTCACGAAAATGCTCCAATATGATCCGGCAGATAGGATTTCAGCAAAAGCTGCACTTGATCATCCATACTTCGATAGCTTGGACAAGTCTCAGTTTTGA
プライマーの塩基配列をExcelにコピーする。
>primer_F ATGGAGAAATACGAGAAATTG >primer_R TCAAAACTGAGACTTGTCC
primer_Fの場所をfind関数を使って調べる。
primer_Rの相補鎖を入力する。その配列の位置をfind関数を使って調べる。
PCR産物の長さはプライマーの長さも含むのでプライマーの長さを加える(位置調節のためにさらに-1)。

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