157.110.120.101: ページの作成:「NOTOC == 試薬 == * 0.4M NaOH * 0.1M Tris-HCl pH 6.8 == DNA抽出　マルチビーズショッカー== # 葉を一枚切り取り、サンプル破砕用チュー...」

2023-08-04T05:59:38Z

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__NOTOC__
== 試薬 ==
* 0.4M NaOH
* 0.1M Tris-HCl pH 6.8

== DNA抽出　マルチビーズショッカー==
# 葉を一枚切り取り、サンプル破砕用チューブに入れる
# ビーズを一粒入れる
# 40 µlの0.4M NaOHを入れる
# 2000rpmで5秒オン、2秒オフのサイクルを2回行う
# 遠心(フラッシュ)
# 200 µlの0.1M Tris-HClを加える
# よく混合し、遠心(フラッシュ)
# 上清を鋳型として用いる

== PCR ==
=== 反応液の組成 ===
{| class='wikitable'
|||1サンプル
|-
|ExTaq||style="text-align:right;"|0.1 µl
|-
|10×ExTaq Buffer||style="text-align:right;"|2 µl
|-
|2.5mM dNTP||style="text-align:right;"|1.6 µl
|-
|プライマー||style="text-align:right;"|終濃度0.2 µM
|-
|プライマー||style="text-align:right;"|終濃度0.2 µM
|-
|DNA||style="text-align:right;"|1 µl
|-
|滅菌水||style="text-align:right;"| up to 20 µl
|-
|合計||style="text-align:right;"|20 µl
|}

=== 反応 ===
# 95℃ 3分
# [95℃ 45秒、(アニーリング)55℃ 45秒、(伸長反応)72℃ 2分] のサイクルを35回
# 72℃ 5分 (→ 4℃ ∞)

==== ＜drol1変異体の判別方法＞ ====

{| class="wikitable"
|-
! !! 判定する 遺伝子型 !! プライマーの組み合せ !! アニーリング温度 !! 伸長時間 !! PCR後の バンドの長さ !! 備考
|-
| width="5pt" |'''[A]''' || width="50pt" |'''drol1-1''' || width="120pt" |・At3g24730#143-F ・drol1-1_HindIII || 55℃ || 1 min でOK || width="110pt" |(185 bp) || このPCR産物をさらに制限酵素 Hind III で切って判別　※方法は下記参照 '''HindIII処理後、(WT)185 bp　 (drol1-1)152 + 33 bp'''

|-
| '''[B]''' || '''drol1-2''' ||・At3g24730#143-F ・drol1-1_HindIII ・LBb1.3|| 55℃ || 2 min || '''「WT」 185 bp 「T-DNA = drol1-2」 ≒355 bp''' || プライマー3種類を混ぜて、「WT」「T-DNA = drol1-2」の判別を1回のPCRで判定 ※各々の増幅プライマーの組み合せ ・「WT」：At3g24730#143-F, drol1-1_HindIII ・「T-DNA = drol1-2」：At3g24730#143-F, LBb1.3

|-
| '''[C]''' || '''drol1-1, drol1-2''' ※同時に判別する場合 ||・At3g24730#143-F ・drol1-1_HindIII ・LBb1.3|| 55℃ || 2 min || 「WT」「drol1-1」 185 bp 「T-DNA = drol1-2」 ≒355 bp || 上記の[A][B]を組み合わせた検出方法 PCR後に制限酵素 Hind III で切って判別 '''HindIII処理後、(WT)185 bp　 (drol1-1)152 + 33 bp　 (drol1-2)≒355 bp'''

|-
| '''[D]''' || '''drol1-2''' ※old ver. 上記推奨||「WT」 ・At3g24730#143-F ・anti6_At3724730 「T-DNA = drol1-2」 ・At3g24730#143-F ・LBb1.3|| 55℃ || 2 min || 「WT」 371 bp 「T-DNA = drol1-2」 ≒355 bp || 各個体について、「WT」「T-DNA = drol1-2」の2種類のPCRを行った結果を合わせて判断。 このプライマーでは、「WT」「T-DNA = drol1-2」のバンドの長さの差が小さいため、上記[B]のようなプライマー3種類を混ぜたPCRでは判別できない

|-
|}

==== ＜drol1-1変異体の判別（Hind III 処理）＞ ====

{| class='wikitable'
|||1サンプル
|-
|滅菌水||style="text-align:right;"| 5.7 µl
|-
|10xM Buffer||style="text-align:right;"|1 µl
|-
|Hind III||style="text-align:right;"|0.3 µl
|-
|PCR産物（上記参照）||style="text-align:right;"|3 µl
|-
|合計||style="text-align:right;"|10 µl
|}→　37℃で1～2時間反応
 MultiNAで泳動し、バンドの長さを判別
　※Hind III処理後、(WT)185 bp 　(drol1-1)152 + 33 bp

==== ＜各drol1変異体の変異箇所とプライマーの結合部位＞ ====
[[ファイル:drol1_genotyping.png]]

シロイヌナズナの遺伝子型の判定（2023年8月以前のver.） - 変更履歴

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