「NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit」を編集中

=== ポリA精製 ===
# 10 ng - 1 µgのRNAを50µlにする
# NEBNext Oligo d(T)25 beads 20µl x サンプル数をエッペンに分注する。
# RNA Binding Buffer (2x) 100 µl x サンプル数を加え、ビーズを洗う。遠心して、ビーズを沈殿させ、磁性体スタンドに置く。上清を捨てビーズを回収する。2回行う。
# RNA Binding Buffer (2x) 50 µl x サンプル数を加え、懸濁する。
# 懸濁したビーズ50µlをRNAに加える。
# 65℃で5分間保温する。その後氷につけて冷やす。
# ビーズを懸濁しながら室温で5分間保温する。
# 遠心後、磁性体スタンドに置き、上清を捨てる。
# Wash Buffer 200µlを加え、懸濁する。スタンドに置いて上清を捨てる。2回行う。
# Tris Buffer 50µlを加え、懸濁する。
# 80℃で2分保温する。その後氷につけて冷やす。
# RNA Binding Buffer (2x) 50µlを加え、懸濁する。懸濁しながら室温で5分間温める。
# 遠心後、磁性体スタンドに置き、上清を捨てる。
# Wash Buffer 200µlを加え、懸濁する。スタンドに置いて上清を捨てる。
# First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X) 8 µl、NEBNext Random Primers 2 µlを加える。''試薬はピンクの印''
# 94℃で10分間保温する。氷につけて室温に戻す。
# 遠心後、磁性体スタンドに置き、上清を新しいチューブに回収する。

=== cDNA合成 ===
# NEBNext First Strand Synthesis Enzyme Mix 2 µl、水 8 µlを加える。''試薬はピンクの印''
# 25℃で10分、42℃で15分、70℃で15分保温する。
# NEBNext Second Strand Synthesis Reaction Buffer (10x) 8 µl、NEBNext Second Strand Synthesis Enzyme Mix 4 µl、水 48 µlを加える。''試薬はオレンジの印''
# 16℃で1時間保温する。

=== DNA精製 ===
# AMPure XP 144 µl (1.8倍量)を加えて、よく撹拌して、5分間室温で放置する。
# 遠心後、磁性体スタンドに置き、上清を捨てる。
# 200 &#181;l 80%エタノールを加え、30秒後、上清を捨てる。スタンドから外して混ぜたりする必要はない。2回行う。
# 遠心して上清を捨てたあと、5分間乾燥させる。
# 50.5 &#181;l RSB (TruSeqのキットに付属)を加え、懸濁する。2分室温で放置する。
# 上清 50 &#181;l を回収する。ここで止められる(-20℃)。

=== 末端形成 ===
# NEBNext Ultra II End Prep Reaction Buffer (10x) 7 µl、NEBNext Ultra II End Prep Enzyme Mix 3 µlを加える。''試薬は緑の印''
# 20℃で30分間、65℃で30分間、保温する。

=== アダプター結合 ===
# NEBNext AdaptorをAdapter Dilution Bufferで5倍に希釈する。最初のRNAが250ng未満のときはさらに5倍希釈する。100ng未満のときはさらに4倍希釈する。
# 希釈したAdaptor 2.5 µl、NEBNext Ligation Enhancer 1 µl、NEBNext Ultra II Ligation Master Mix 30 µlを加える。''試薬は赤の印''
# 20℃で15分間保温する。
# USER Enzyme 3 µlを加える。
# 37℃で15分間保温する。
# AMPure XP 100 µl (等量)を加え、精製する。16 &#181;l RSBを加え、15 &#181;l 回収する。

=== PCR (約1.5時間) ===
# Index Primer 2.5 &#181;l、Universal PCR Primer 2.5 &#181;l 、NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix 25  &#181;lを加える。
# 95℃で3分、(98℃で10秒、65℃で75秒) x 8 cycle、65℃で5分、のPCRを行う。
# AMPure XP 45 µl (0.9倍量)を加え、精製する。23 &#181;l RSBを加え、21 &#181;l 回収する。ここで止められる(-20℃)。