「シロイヌナズナのゲノム編集について：概要、変異アリルの検出・同定」を編集中

'''（注意：編集中！）'''　CRISPR-Cas9でゲノム編集した植物のシークエンスを解析し、変異を同定する方法についての解説。

==[1]（概要）ゲノム編集で変異体を作成する手順：pKIベクターを用いた場合==
* 以下の説明は、pKIベクターの解説サイトの図に一部加筆したもの　　https://www.jst.go.jp/pr/announce/20161117-2/index.html
:::（※ ガイドRNAの設計方法については、別記参照)

[[File:PKIベクターでのゲノム編集概要.png|700px]]

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!アグロバクテリウムの感染後、シークエンス解析に至るまでの流れ　（概要説明）
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|1) 形質転換されたT1植物を選抜し、生育する
:* pKIベクターを用いた場合、T1種子の中から「OLE-tagRFPが光る」ものを播いて育てる　（＝T-DNAが組み込まれている）
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|2) 目的の遺伝子がゲノム編集されている個体を選抜・生育し、T2種子をとる<BR>
:* genotyping：PCR＋制限酵素処理で、変異遺伝子を持つ個体を選抜　（制限酵素処理で、切れる：野生型（WT型）、切れない：変異型）
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|3) T2世代で、Cas9を持たない植物を選抜する
:* pKIベクターを用いた場合、T2種子の中から「OLE-tagRFPが光らない」ものを播いて育てる　（＝T-DNA、Cas9を持たない）
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|4) T2世代で、目的の遺伝子がゲノム編集されている個体を選抜する
:* 2) と同様のgenotypingを実施
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|5) キャピラリーシークエンサーでの解析
:* 4) のgenotypingの時のPCR産物（制限酵素処理する前のもの）を、キャピラリーシークエンサーで解析する
::* PCRに用いた両端のプライマー各々で解析したファイルを作成。このファイルを用いて以降の解析を行う
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|}

==[2] ゲノム編集によってできる変異型のアリルについて==
* CRISPR-Cas9によるゲノム編集では、PAM配列（NGG）の3塩基手前が切断される
* その切断個所を修復する際に、「挿入・欠失 (indel)」が生じて、フレームシフト等の変異型アリルができる

::* 以下は、ゲノム編集での変異アリルの例
:::[[File:ゲノム編集での変異アリルの例.png|700px]]
::* 挿入・欠失 (indel) は上記の例のように、数bpの場合もあれば、数十bp～100bp以上の場合もある

==[3] 変異型アリルの検出（遺伝子型の同定：genotyping）==
* ゲノム変種による変異の有無を検出できるように、制限酵素サイトの近傍にsgRNAを設計する　（変異が生じると制限酵素サイトが無くなる）
:* sgRNAの配列と検出に用いた制限酵素の例、については上記[2]の図を参照
:* この例では、383bpのPCR産物をHaeIII処理すると、以下の長さの断片になる
::・（野生型）制限酵素(HaeIII)で切れる　　->　272bp, 111bp の2本の断片
::・（変異型）制限酵素(HaeIII)で切れない　->　約383bp の断片
:* 遺伝子型の同定を行う際の「DNA抽出、PCR、制限酵素処理」の手順については、「[[シロイヌナズナの遺伝子型の判定]]」を参照

==[4] 変異型アリルの同定（ゲノム編集した植物のシークエンス解析）==
'''(1) キャピラリーシークエンスを行う'''
:* [3]で用いたPCR産物（制限酵素処理"前"のもの）を用いて、シークエンス解析を行う
:* キャピラリーシークエンスの方法は、「[[BigDye Terminaterを使ったシークエンス]]」を参照
:::* シークエンス反応時に使うプライマーは、[3]のPCRで使用した両側のプライマー
:::::＝PCR産物１個につき、シークエンスは２サンプル、となる　（両側のプライマー＝センス、アンチセンスの２種類で読むため
:::* 1反応 (計10ul) あたりに、PCR産物を "1ul" 使用する　
::::（プライマーダイマーがある場合は、精製・定量したうえで、プロトコール通りの量を使用　（精製方法：[[NucleoSpin Gel and PCR Clean-upを使ったDNA精製]]）

'''(2) 解析に使うデータ（ファイル）を準備する'''
:* キャピラリーシークエンサーで読んだ波形ファイル（拡張子.ab1）　※上記(1)で得られたデータ
:* ゲノム編集した「遺伝子のもとの配列」の情報（sgRNA配列の位置がわかるもの）

'''(3) シークエンスデータを解読して配列を決定し、アリルを同定する'''
:* シークエンスデータの解読方法については、「[[ゲノム編集した植物のシークエンスの解析]]」を参照
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[[ゲノム編集した植物のシークエンスの解析：シーケンスアセンブリソフトウェア「ATGC」を使う場合]]