BigDye Terminaterを使ったシークエンス
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2017年10月6日 (金) 16:49時点における版
BigDye Terminaterを使ったシークエンス
試薬
- BigDye Terminator V3.1 Ready Reaction mix
- BigDye Terminator V3.1 5×Sequencing Buffer
- プライマー (0.8μM)
- 125mM EDTA
- 100%エタノール
- 70%エタノール
- HiDi ホルムアミド
実験方法
- 試薬5種(BigDye、BigDye用buffer、プライマー、RNA産物、脱イオン水)を8連チューブに入れて、混ぜる
- PCR反応させる
- 96℃ 10秒
- 50℃ 5秒
- 60℃ 1分
- 25サイクル
- 12℃ ∞
- エッペン管にPCR産物、3M NaOAc、100%エタノールを加え、Maxrpmで20分遠心
- 室温で20分放置
- 70%エタノールを加え、Maxrpmで5分遠心
- エタノールを抜いて、2分乾燥
- HiDiホルムアシドを加え、heatshock 95℃、2分
- 氷で冷やし、ボルテックスと遠心
- シークエンス用の容器に全量入れる
シークエンス
- バッファーと蒸留水の交換は10日で必要なので、予めシーケンサーの使用簿を確認すること**
- 空気抜きを忘れないこと**
