RAD-Seqのライブラリ作成
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(ページの作成:「==アダプターの作成== ====Illumina Read2==== Illumina Read2(50μM) 5μl T4 Polynucleotide Kinase 0.5μl 10x Buffer for T4 DNA Ligase with 10mM ATP 2μl H2O 12...」) |
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T4 Polynucleotide Kinase 0.5μl | T4 Polynucleotide Kinase 0.5μl | ||
10x Buffer for T4 DNA Ligase with 10mM ATP 2μl | 10x Buffer for T4 DNA Ligase with 10mM ATP 2μl | ||
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を混ぜる。 | を混ぜる。 | ||
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Illumina Read2_RT(50μM) 5μl | Illumina Read2_RT(50μM) 5μl | ||
10x Buffer H 3μl | 10x Buffer H 3μl | ||
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を加える。 | を加える。 | ||
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#30℃になるまで、５分おきに温度を記録する。（１分あたり-1℃が目安） | #30℃になるまで、５分おきに温度を記録する。（１分あたり-1℃が目安） | ||
#エタノール沈殿をする。 | #エタノール沈殿をする。 | ||
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====RAD Seq==== | ====RAD Seq==== | ||
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RAD Seq R(50μM) 5μl | RAD Seq R(50μM) 5μl | ||
10x Buffer H 3μl | 10x Buffer H 3μl | ||
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を混ぜる。 | を混ぜる。 | ||
#95℃で5分間保温する。 | #95℃で5分間保温する。 | ||
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#30℃になるまで、５分おきに温度を記録する。（１分あたり-1℃が目安） | #30℃になるまで、５分おきに温度を記録する。（１分あたり-1℃が目安） | ||
#エタノール沈殿をする。 | #エタノール沈殿をする。 | ||
| − | # | + | #H<sub>2</sub>O 10μlに溶かす。 |
==エタノール沈殿== | ==エタノール沈殿== | ||
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#上清を廃棄。 | #上清を廃棄。 | ||
#遠心エバポレーターで2分間乾燥。 | #遠心エバポレーターで2分間乾燥。 | ||
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| + | ==制限酵素切断== | ||
| + | DNA 1μg | ||
| + | BamHⅠ 1μl | ||
| + | 10x Buffer K 2μl | ||
| + | H<sub>2</sub>O | ||
| + | 合計 20μl | ||
| + | を混ぜる。 | ||
| + | #37℃で1時間保温する。 | ||
| + | #エタノール沈殿する。 | ||
| + | #H<sub>2</sub>O 10μlに溶かす。 | ||
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| + | ==アダプター(RAD Seq)の結合== | ||
| + | DNA 5μl | ||
| + | RAD Seq 10pmol | ||
| + | T4 DNA Ligase 0.5μl | ||
| + | 10x Buffer for T4 DNA Ligase with 10mM ATP 1μl | ||
| + | H<sub>2</sub>O | ||
| + | 合計 10μl | ||
| + | を混ぜる。 | ||
| + | #20℃で1時間保温する。 | ||
| + | #70℃で10分間保温する。 | ||
| + | #異なるアダプターを加えたサンプルをまとめ、H<sub>2</sub>Oを加えて50μlにする。 | ||
| + | #Covarisで超音波断片化する。 | ||
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| + | ==AMPure精製== | ||
| + | #AMPure XPを加える。 | ||
| + | #よく混合して、室温で5分間静置する。 | ||
| + | #10000rpm、5秒間遠心。 | ||
| + | #磁性スタンドに立て、2分間静置。 | ||
| + | #磁性スタンドに立てたまま、マイクロピペットで上清を廃棄する。 | ||
| + | #70%EtOHを200μl添加する。 | ||
| + | #室温で30秒間静置、上清を廃棄。 | ||
| + | #70%EtOHを200μl添加する。 | ||
| + | #室温で30秒間静置、上清を廃棄。 | ||
| + | #10000rpm、5秒間遠心。 | ||
| + | #磁性スタンドに立て、上清を廃棄。 | ||
| + | #室温で5分間蓋を開けて乾燥させる。 | ||
| + | #Resuspension Buffer(RSB)を添加し、よく混合する。 | ||
| + | #室温で2分間静置する。10000rpm、５秒間遠心。 | ||
| + | #磁性スタンドに立て、上清を回収する。 | ||
2018年10月22日 (月) 12:40時点における版
目次 |
アダプターの作成
Illumina Read2
Illumina Read2(50μM) 5μl T4 Polynucleotide Kinase 0.5μl 10x Buffer for T4 DNA Ligase with 10mM ATP 2μl H2O 12μl
を混ぜる。
- 37℃で30分間保温する。
- 65℃で20分間保温する。
Illumina Read2_RT(50μM) 5μl 10x Buffer H 3μl H2O 2μl
を加える。
- 95℃で5分間保温する。
- ヒートブロックの電源をoffにする。
- 30℃になるまで、５分おきに温度を記録する。（１分あたり-1℃が目安）
- エタノール沈殿をする。
- H2O 10μlに溶かす。
RAD Seq
RAD Seq F(50μM) 5μl RAD Seq R(50μM) 5μl 10x Buffer H 3μl H2O 17μl
を混ぜる。
- 95℃で5分間保温する。
- ヒートブロックの電源をoffにする。
- 30℃になるまで、５分おきに温度を記録する。（１分あたり-1℃が目安）
- エタノール沈殿をする。
- H2O 10μlに溶かす。
エタノール沈殿
サンプルの1/10量の3M NaOAc サンプルの2.5倍量の100% EtOH
を加えて、混合する。
- -20℃に20分間置く。
- 4℃、15000rpm、15分間遠心。
- アスピレーターで上清を廃棄する。
- 半量の70%EtOHを加える。
- 4℃、15000rpm、5分間遠心。
- 上清を廃棄。
- 遠心エバポレーターで2分間乾燥。
制限酵素切断
DNA 1μg BamHⅠ 1μl 10x Buffer K 2μl H2O 合計 20μl
を混ぜる。
- 37℃で1時間保温する。
- エタノール沈殿する。
- H2O 10μlに溶かす。
アダプター(RAD Seq)の結合
DNA 5μl RAD Seq 10pmol T4 DNA Ligase 0.5μl 10x Buffer for T4 DNA Ligase with 10mM ATP 1μl H2O 合計 10μl
を混ぜる。
- 20℃で1時間保温する。
- 70℃で10分間保温する。
- 異なるアダプターを加えたサンプルをまとめ、H2Oを加えて50μlにする。
- Covarisで超音波断片化する。
AMPure精製
- AMPure XPを加える。
- よく混合して、室温で5分間静置する。
- 10000rpm、5秒間遠心。
- 磁性スタンドに立て、2分間静置。
- 磁性スタンドに立てたまま、マイクロピペットで上清を廃棄する。
- 70%EtOHを200μl添加する。
- 室温で30秒間静置、上清を廃棄。
- 70%EtOHを200μl添加する。
- 室温で30秒間静置、上清を廃棄。
- 10000rpm、5秒間遠心。
- 磁性スタンドに立て、上清を廃棄。
- 室温で5分間蓋を開けて乾燥させる。
- Resuspension Buffer(RSB)を添加し、よく混合する。
- 室温で2分間静置する。10000rpm、５秒間遠心。
- 磁性スタンドに立て、上清を回収する。
