RAD-Seqのライブラリ作成
提供: 鈴木研Wiki
(版間での差分)
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==アダプターの作成== | ==アダプターの作成== | ||
====Illumina Read2==== | ====Illumina Read2==== | ||
| − | Illumina Read2(50μM) | + | Illumina Read2(50μM) 5µl |
T4 Polynucleotide Kinase 0.5μl | T4 Polynucleotide Kinase 0.5μl | ||
10x Buffer for T4 DNA Ligase with 10mM ATP 2μl | 10x Buffer for T4 DNA Ligase with 10mM ATP 2μl | ||
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DNA 1μg | DNA 1μg | ||
BamHⅠ 1μl | BamHⅠ 1μl | ||
| − | 10x Buffer K | + | 10x Buffer K 2µl |
H<sub>2</sub>O | H<sub>2</sub>O | ||
合計 20μl | 合計 20μl | ||
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#異なるアダプターを加えたサンプルをまとめ、H<sub>2</sub>Oを加えて50μlにする。 | #異なるアダプターを加えたサンプルをまとめ、H<sub>2</sub>Oを加えて50μlにする。 | ||
#Covarisで超音波断片化する。 | #Covarisで超音波断片化する。 | ||
| + | #AMPureで精製する。 | ||
| + | #:*AMPure 80μl | ||
| + | #:*RSB 44µl加え、42µl回収 | ||
| + | #End Prep Enzyme Mix 3µl、End Repair Reaction Buffer 5µlを加える。 | ||
| + | #20℃で30分間保温する。 | ||
| + | #65℃で30分間保温する。 | ||
| + | #エタノール沈殿する。 | ||
| + | #H<sub>2</sub>O 12μlで溶かす。 | ||
| + | |||
| + | ==アダプター(Illumina Read2)の結合== | ||
| + | DNA 10µl | ||
| + | Illumina Read2 20pmol | ||
| + | T4 DNA Ligase 1μl | ||
| + | 10x Buffer for T4 DNA Ligase with 10mM ATP 2μl | ||
| + | H<sub>2</sub>O | ||
| + | 合計 20μl | ||
| + | を混ぜる。 | ||
| + | #20℃で1時間保温する。 | ||
| + | #70℃で10分間保温する。 | ||
| + | #RSB 30µlkを加える。 | ||
| + | #サイズ分画する。 | ||
| + | #:*RSB 22μl加え、20µl回収 | ||
| + | |||
| + | ==PCR増幅== | ||
| + | DNA 10µl | ||
| + | Universal Primer(10µM) 2.5µl | ||
| + | Index Primer(10µM) 2.5µl | ||
| + | PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0.5µl | ||
| + | 5x Buffer 10µl | ||
| + | dNTP Mixture 4µl | ||
| + | H<sub>2</sub>O | ||
| + | 合計 50µl | ||
| + | を混ぜる。 | ||
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| + | :98℃ 30秒 | ||
| + | <hr width="150"> | ||
| + | :98℃ 10秒 | ||
| + | :65℃ 1分15秒 | ||
| + | :x15 | ||
| + | <hr width="150"> | ||
| + | :65℃ 5分 | ||
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| + | :4℃ ∞ | ||
| + | <hr width="150"> | ||
| + | でPCR反応を行う。 | ||
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| + | AMPureで精製する。 | ||
| + | :*AMPure 50µl | ||
| + | :*RSB 32.5µl加え、30µl回収 | ||
==AMPure精製== | ==AMPure精製== | ||
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#室温で2分間静置する。10000rpm、５秒間遠心。 | #室温で2分間静置する。10000rpm、５秒間遠心。 | ||
#磁性スタンドに立て、上清を回収する。 | #磁性スタンドに立て、上清を回収する。 | ||
| + | |||
| + | ==サイズ分画== | ||
| + | AMPure XP 60µl | ||
| + | H<sub>2</sub>O 40µl | ||
| + | を混ぜ、AMPureを希釈する。 | ||
| + | #希釈したAMPure 80µlを加え、よく混合する。 | ||
| + | #室温で5分間静置して、遠心する。 | ||
| + | #磁性スタンドに立て、上清を回収する。 | ||
| + | #AMPure 15µlを加えて、精製する。 | ||
2018年10月22日 (月) 14:10時点における版
目次 |
アダプターの作成
Illumina Read2
Illumina Read2(50μM) 5µl T4 Polynucleotide Kinase 0.5μl 10x Buffer for T4 DNA Ligase with 10mM ATP 2μl H2O 12μl
を混ぜる。
- 37℃で30分間保温する。
- 65℃で20分間保温する。
Illumina Read2_RT(50μM) 5μl 10x Buffer H 3μl H2O 2μl
を加える。
- 95℃で5分間保温する。
- ヒートブロックの電源をoffにする。
- 30℃になるまで、５分おきに温度を記録する。（１分あたり-1℃が目安）
- エタノール沈殿をする。
- H2O 10μlに溶かす。
RAD Seq
RAD Seq F(50μM) 5μl RAD Seq R(50μM) 5μl 10x Buffer H 3μl H2O 17μl
を混ぜる。
- 95℃で5分間保温する。
- ヒートブロックの電源をoffにする。
- 30℃になるまで、５分おきに温度を記録する。（１分あたり-1℃が目安）
- エタノール沈殿をする。
- H2O 10μlに溶かす。
エタノール沈殿
サンプルの1/10量の3M NaOAc サンプルの2.5倍量の100% EtOH
を加えて、混合する。
- -20℃に20分間置く。
- 4℃、15000rpm、15分間遠心。
- アスピレーターで上清を廃棄する。
- 半量の70%EtOHを加える。
- 4℃、15000rpm、5分間遠心。
- 上清を廃棄。
- 遠心エバポレーターで2分間乾燥。
制限酵素切断
DNA 1μg BamHⅠ 1μl 10x Buffer K 2µl H2O 合計 20μl
を混ぜる。
- 37℃で1時間保温する。
- エタノール沈殿する。
- H2O 10μlに溶かす。
アダプター(RAD Seq)の結合
DNA 5μl RAD Seq 10pmol T4 DNA Ligase 0.5μl 10x Buffer for T4 DNA Ligase with 10mM ATP 1μl H2O 合計 10μl
を混ぜる。
- 20℃で1時間保温する。
- 70℃で10分間保温する。
- 異なるアダプターを加えたサンプルをまとめ、H2Oを加えて50μlにする。
- Covarisで超音波断片化する。
- AMPureで精製する。
- AMPure 80μl
- RSB 44µl加え、42µl回収
- End Prep Enzyme Mix 3µl、End Repair Reaction Buffer 5µlを加える。
- 20℃で30分間保温する。
- 65℃で30分間保温する。
- エタノール沈殿する。
- H2O 12μlで溶かす。
アダプター(Illumina Read2)の結合
DNA 10µl Illumina Read2 20pmol T4 DNA Ligase 1μl 10x Buffer for T4 DNA Ligase with 10mM ATP 2μl H2O 合計 20μl
を混ぜる。
- 20℃で1時間保温する。
- 70℃で10分間保温する。
- RSB 30µlkを加える。
- サイズ分画する。
- RSB 22μl加え、20µl回収
PCR増幅
DNA 10µl Universal Primer(10µM) 2.5µl Index Primer(10µM) 2.5µl PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0.5µl 5x Buffer 10µl dNTP Mixture 4µl H2O 合計 50µl
を混ぜる。
- 98℃ 30秒
- 98℃ 10秒
- 65℃ 1分15秒
- x15
- 65℃ 5分
- 4℃ ∞
でPCR反応を行う。
AMPureで精製する。
- AMPure 50µl
- RSB 32.5µl加え、30µl回収
AMPure精製
- AMPure XPを加える。
- よく混合して、室温で5分間静置する。
- 10000rpm、5秒間遠心。
- 磁性スタンドに立て、2分間静置。
- 磁性スタンドに立てたまま、マイクロピペットで上清を廃棄する。
- 70%EtOHを200μl添加する。
- 室温で30秒間静置、上清を廃棄。
- 70%EtOHを200μl添加する。
- 室温で30秒間静置、上清を廃棄。
- 10000rpm、5秒間遠心。
- 磁性スタンドに立て、上清を廃棄。
- 室温で5分間蓋を開けて乾燥させる。
- Resuspension Buffer(RSB)を添加し、よく混合する。
- 室温で2分間静置する。10000rpm、５秒間遠心。
- 磁性スタンドに立て、上清を回収する。
サイズ分画
AMPure XP 60µl H2O 40µl
を混ぜ、AMPureを希釈する。
- 希釈したAMPure 80µlを加え、よく混合する。
- 室温で5分間静置して、遠心する。
- 磁性スタンドに立て、上清を回収する。
- AMPure 15µlを加えて、精製する。
