RAD-Seqのライブラリ作成
提供: 鈴木研Wiki
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#-20℃に20分間置く。 | #-20℃に20分間置く。 | ||
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2018年10月22日 (月) 16:17時点における版
目次 |
アダプターの作成
Illumina Read2
- 以下のように試薬を混ぜる。
Illumina Read2(50μM) 5µl T4 Polynucleotide Kinase 0.5μl 10x Buffer for T4 DNA Ligase with 10mM ATP 2μl H2O 12μl 合計 20μl
- 37℃で30分間保温する。
- 65℃で20分間保温する。
- 以下の試薬を加える。
Illumina Read2_RT(50μM) 5μl 10x Buffer H 3μl H2O 2μl 合計 30µl
- 95℃で5分間保温する。
- ヒートブロックの電源をoffにする。
- 30℃になるまで、５分おきに温度を記録する。（１分あたり-1℃が目安）
- エタノール沈殿をする。
- H2O 10μlに溶かす。
- DNAの定量を行う。
RAD Seq
- 以下のように試薬を混ぜる。
RAD Seq F(50μM) 5μl RAD Seq R(50μM) 5μl 10x Buffer H 3μl H2O 17μl 合計 30µM
- 95℃で5分間保温する。
- ヒートブロックの電源をoffにする。
- 30℃になるまで、５分おきに温度を記録する。（１分あたり-1℃が目安）
- エタノール沈殿をする。
- H2O 10μlに溶かす。
- DNAの定量を行う。
制限酵素切断
- 以下のように試薬を混ぜる。
DNA 1μg BamHⅠ 1μl 10x Buffer K 2µl H2O 合計 20μl
- 37℃で1時間保温する。
- エタノール沈殿する。
- H2O 10μlに溶かす。
アダプター(RAD Seq)の結合
- 以下のように試薬を混ぜる。
DNA 5μl RAD Seq 10pmol T4 DNA Ligase 0.5μl 10x Buffer for T4 DNA Ligase with 10mM ATP 1μl H2O 合計 10μl
- 20℃で1時間保温する。
- 70℃で10分間保温する。
- 異なるアダプターを加えたサンプルをまとめ、H2Oを加えて50μlにする。
- Covarisで超音波断片化する。
- サイズ分画する。
AMPureで精製する。- AMPure 80μl
- RSB 44µl加え、42µl回収
- End Prep Enzyme Mix 3µl、End Repair Reaction Buffer 5µlを加える。
- 20℃で30分間保温する。
- 65℃で30分間保温する。
- エタノール沈殿する。
- H2O 12μlで溶かす。
アダプター(Illumina Read2)の結合
- 以下のように試薬を混ぜる。
DNA 10µl Illumina Read2 20pmol T4 DNA Ligase 1μl 10x Buffer for T4 DNA Ligase with 10mM ATP 2μl H2O 合計 20μl
- 20℃で1時間保温する。
- 70℃で10分間保温する。
- RSB 30µlkを加える。
- AMPure精製する。
サイズ分画する。- AMPure 80µl
- RSB 22μl加え、20µl回収
PCR増幅
- 1. 以下のように試薬を混ぜる。
DNA 10µl Universal Primer(10µM) 2.5µl Index Primer(10µM) 2.5µl PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0.5µl 5x Buffer 10µl dNTP Mixture 4µl H2O 20.5µl 合計 50µl
- 2. 以下の条件でPCR反応を行う。
98℃ 30秒 98℃ 10秒 x15 65℃ 1分15秒 65℃ 5分 4℃ ∞
- 3. AMPureで精製する。
- AMPure 50µl
- RSB 32.5µl加え、30µl回収
エタノール沈殿
- 以下の試薬を加え、よく混合する。
3M NaOAc 1/10量 100%EtOH 2.5倍量
- -20℃に20分間置く。
- 4℃、15000rpm、15分間遠心。
- アスピレーターで上清を廃棄する。
- 半量の70%EtOHを加える。
- 4℃、15000rpm、5分間遠心。
- 上清を廃棄。
- 遠心エバポレーターで2分間乾燥。
サイズ分画
AMPure XP 60µl H2O 40µl
を混ぜ、AMPureを希釈する。
- 希釈したAMPure 80µlを加え、よく混合する。
- 室温で5分間静置して、遠心する。
- 磁性スタンドに立て、上清を回収する。
- AMPure 15µlを加えて、精製する。
AMPure精製
- AMPure XPを加える。
- よく混合して、室温で5分間静置する。
- 10000rpm、5秒間遠心。
- 磁性スタンドに立て、2分間静置。
- 磁性スタンドに立てたまま、マイクロピペットで上清を廃棄する。
- 70%EtOHを200μl添加する。
- 室温で30秒間静置、上清を廃棄。
- 70%EtOHを200μl添加する。
- 室温で30秒間静置、上清を廃棄。
- 10000rpm、5秒間遠心。
- 磁性スタンドに立て、上清を廃棄。
- 室温で5分間蓋を開けて乾燥させる。
- Resuspension Buffer(RSB)を添加し、よく混合する。
- 室温で2分間静置する。10000rpm、５秒間遠心。
- 磁性スタンドに立て、上清を回収する。
