RAD-Seqのライブラリ作成
提供: 鈴木研Wiki
(版間での差分)
(→アダプターの作成) |
(→Illumina Read2) |
||
| 48行: | 48行: | ||
Illumina Read2のアダプターはライゲーションのためにリン酸化させる。 | Illumina Read2のアダプターはライゲーションのためにリン酸化させる。 | ||
| − | #以下のように試薬を混ぜる。 | + | # 以下のように試薬を混ぜる。 |
::{| class="wikitable" | ::{| class="wikitable" | ||
|Illumina Read2(50 µM)||5 µl ||濃度12.5µM | |Illumina Read2(50 µM)||5 µl ||濃度12.5µM | ||
| 61行: | 61行: | ||
|20 µl | |20 µl | ||
|} | |} | ||
| − | + | # 37℃で30分間保温する。 | |
| − | #37℃で30分間保温する。 | + | # 65℃で20分間保温する。 |
| − | #65℃で20分間保温する。 | + | # 以下の試薬を加える。 |
| − | #以下の試薬を加える。 | + | |
::{|class="wikitable" | ::{|class="wikitable" | ||
|Illumina Read2_RT(50μM)||5 µl<!--||濃度8.3µM--> | |Illumina Read2_RT(50μM)||5 µl<!--||濃度8.3µM--> | ||
|- | |- | ||
| − | |10x Buffer H|| | + | |10x Buffer H||3 µl |
|- | |- | ||
| − | |H<sub>2</sub>O|| | + | |H<sub>2</sub>O||2 µl |
|- | |- | ||
!合計 | !合計 | ||
| − | | | + | |30 µl |
|} | |} | ||
| 87行: | 86行: | ||
#以下のように試薬を混ぜる。 | #以下のように試薬を混ぜる。 | ||
::{|class="wikitable" | ::{|class="wikitable" | ||
| − | |RAD Seq F( | + | |RAD Seq F(50 µM)||5 µl<!--||濃度8.3µM--> |
|- | |- | ||
| − | |RAD Seq R( | + | |RAD Seq R(50 µM)||5 µl<!--||濃度8.3µM--> |
|- | |- | ||
| − | |10x Buffer H|| | + | |10x Buffer H||3 µl |
|- | |- | ||
| − | |H<sub>2</sub>O|| | + | |H<sub>2</sub>O||17 µl |
|- | |- | ||
!合計 | !合計 | ||
| − | | | + | |30 µM |
|} | |} | ||
#95℃で5分間保温する。 | #95℃で5分間保温する。 | ||
#ヒートブロックの電源をoffにする。 | #ヒートブロックの電源をoffにする。 | ||
| − | # | + | #30℃になるまで、5分おきに温度を記録する。（１分あたり-1℃が目安） |
#エタノール沈殿をする。 | #エタノール沈殿をする。 | ||
| − | #H<sub>2</sub>O | + | #H<sub>2</sub>O 10 µlに溶かす。 |
#[[DNAの定量 (Promega QuantiFluor)]]を行う。 | #[[DNAの定量 (Promega QuantiFluor)]]を行う。 | ||
2018年11月5日 (月) 16:05時点における版
目次 |
アダプターの合成
>IlluminaRead2 33mer GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC >IlluminaRead2_RT 34mer 3'側が1塩基(T)突出する GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
>RADSeqB1_F 31 mer 3'側の4塩基がインデックスになる。 TTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCATA >RADSeqB1_R 35mer 5'側が4塩基突出してBamHIの突出末端と相補する。 GATCTATGAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAA >RADSeqB2_F TTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTACTT >RADSeqB2_R GATCAAGTAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAA >RADSeqB3_F TTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTATCC >RADSeqB3_R GATCGGATAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAA >RADSeqB4_F TTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCTAA >RADSeqB4_R GATCTTAGAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAA
オリゴDNAはユーロフィンジェノミクス株式会社に注文。 PCRReadyオリゴDNAとして注文(OPC精製、50µM TE溶液)。
アダプターのハイブリダイゼーション
Illumina Read2
Illumina Read2のアダプターはライゲーションのためにリン酸化させる。
- 以下のように試薬を混ぜる。
Illumina Read2(50 µM) 5 µl 濃度12.5µM T4 Polynucleotide Kinase 0.5 µl 10x Buffer for T4 DNA Ligase with 10mM ATP 2 µl H2O 12 µl 合計 20 µl
- 37℃で30分間保温する。
- 65℃で20分間保温する。
- 以下の試薬を加える。
Illumina Read2_RT(50μM) 5 µl 10x Buffer H 3 µl H2O 2 µl 合計 30 µl
- 95℃で5分間保温する。
- ヒートブロックの電源をoffにする。
- 30℃になるまで、５分おきに温度を記録する。（１分あたり-1℃が目安）
- エタノール沈殿をする。
- H2O 10μlに溶かす。
- DNAの定量 (Promega QuantiFluor)を行う。
RAD Seq
- 以下のように試薬を混ぜる。
RAD Seq F(50 µM) 5 µl RAD Seq R(50 µM) 5 µl 10x Buffer H 3 µl H2O 17 µl 合計 30 µM
- 95℃で5分間保温する。
- ヒートブロックの電源をoffにする。
- 30℃になるまで、5分おきに温度を記録する。（１分あたり-1℃が目安）
- エタノール沈殿をする。
- H2O 10 µlに溶かす。
- DNAの定量 (Promega QuantiFluor)を行う。
制限酵素切断
- DNAの定量 (Promega QuantiFluor)を行う。
- 以下のように試薬を混ぜる。
DNA 1μg BamHⅠ 1μl 10x Buffer K 2µl H2O 合計 20μl
- 37℃で1時間保温する。
- エタノール沈殿する。
- H2O 10μlに溶かす。
- DNAを定量する。
アダプター(RAD Seq)の結合
- 以下のように試薬を混ぜる。
DNA 5μl RAD Seq 10pmol T4 DNA Ligase 0.5μl 10x Buffer for T4 DNA Ligase with 10mM ATP 1μl H2O 合計 10μl
- 20℃で1時間保温する。
- 70℃で10分間保温する。
- 異なるアダプターを加えたサンプルをまとめ、H2Oを加えて50μlにする。
- Covarisで超音波断片化する。
- サイズ分画する。
AMPureで精製する。- AMPure 80μl
- RSB 44µl加え、42µl回収
- End Prep Enzyme Mix 3µl、End Repair Reaction Buffer 5µlを加える。
- 20℃で30分間保温する。
- 65℃で30分間保温する。
- エタノール沈殿する。
- H2O 12μlで溶かす。
- DNAを定量する。
アダプター(Illumina Read2)の結合
- 以下のように試薬を混ぜる。
DNA 10µl Illumina Read2 20pmol T4 DNA Ligase 1μl 10x Buffer for T4 DNA Ligase with 10mM ATP 2μl H2O 合計 20μl
- 20℃で1時間保温する。
- 70℃で10分間保温する。
- RSB 30µlkを加える。
- AMPure精製する。
サイズ分画する。- AMPure 80µl
- RSB 22μl加え、20µl回収
PCR増幅
- 1. 以下のように試薬を混ぜる。
DNA 10µl Universal Primer(10µM) 2.5µl Index Primer(10µM) 2.5µl PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0.5µl 5x Buffer 10µl dNTP Mixture 4µl H2O 20.5µl 合計 50µl
- 2. 以下の条件でPCR反応を行う。
98℃ 30秒 98℃ 10秒 x15 65℃ 1分15秒 65℃ 5分 4℃ ∞
- 3. AMPureで精製する。
- AMPure 50µl
- RSB 32.5µl加え、30µl回収
- 4. DNAを定量する。
エタノール沈殿
- 以下の試薬を加え、よく混合する。
3M NaOAc 1/10量 100%EtOH 2.5倍量
- -20℃に20分間置く。
- 4℃、15000rpm、15分間遠心。
- アスピレーターで上清を廃棄する。
- 半量の70%EtOHを加える。
- 4℃、15000rpm、5分間遠心。
- 上清を廃棄。
- 遠心エバポレーターで2分間乾燥。
サイズ分画
- AMPureを希釈する。
AMPure XP 60µl H2O 40µl 合計 100µM
- 希釈したAMPure 80µlを加え、よく混合する。
- 室温で5分間静置して、遠心する。
- 磁性スタンドに立て、上清を回収する。
- AMPure 15µlを加えて、精製する。
AMPure精製
- AMPure XPを加える。
- よく混合して、室温で5分間静置する。
- 10000rpm、5秒間遠心。
- 磁性スタンドに立て、2分間静置。
- 磁性スタンドに立てたまま、マイクロピペットで上清を廃棄する。
- 70%EtOHを200μl添加する。
- 室温で30秒間静置、上清を廃棄。
- 70%EtOHを200μl添加する。
- 室温で30秒間静置、上清を廃棄。
- 10000rpm、5秒間遠心。
- 磁性スタンドに立て、上清を廃棄。
- 室温で5分間蓋を開けて乾燥させる。
- Resuspension Buffer(RSB)を添加し、よく混合する。
- 室温で2分間静置する。10000rpm、５秒間遠心。
- 磁性スタンドに立て、上清を回収する。
