RAD-Seqのライブラリ作成

2018年11月5日 (月) 16:29時点における版

アダプターの合成

>IlluminaRead2 33mer
GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC
>IlluminaRead2_RT  34mer 3'側が1塩基(T)突出する
GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

>RADSeqB1_F 31 mer 3'側の4塩基がインデックスになる。
TTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCATA
>RADSeqB1_R 35mer 5'側が4塩基突出してBamHIの突出末端と相補する。
GATCTATGAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAA
>RADSeqB2_F
TTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTACTT
>RADSeqB2_R
GATCAAGTAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAA
>RADSeqB3_F
TTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTATCC
>RADSeqB3_R
GATCGGATAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAA
>RADSeqB4_F
TTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCTAA
>RADSeqB4_R
GATCTTAGAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAA

オリゴDNAはユーロフィンジェノミクス株式会社に注文。 PCRReadyオリゴDNAとして注文(OPC精製、50µM TE溶液)。

アダプターのハイブリダイゼーション

Illumina Read2

Illumina Read2のアダプターはライゲーションのためにリン酸化させる。

1. 以下のように試薬を混ぜる。

Illumina Read2(50 µM)	5 µl	濃度12.5µM
T4 Polynucleotide Kinase	0.5 µl
10x Buffer for T4 DNA Ligase with 10mM ATP	2 µl
H2O	12.5 µl
合計	20 µl

1. 37℃で30分間保温する。
2. 65℃で20分間保温する。
3. 以下の試薬を加える。

Illumina Read2_RT(50μM)	5 µl
10x Buffer H	3 µl
H2O	2 µl
反応液合計	30 µl

1. 95℃で5分間保温する。
2. ヒートブロックの電源をoffにする。
3. 30℃になるまで、5分おきに温度を記録する。（１分あたり-1℃が目安）
4. エタノール沈殿をする。
5. H₂O 10 µlに溶かす。
6. DNAの定量 (Promega QuantiFluor)を行う。

RAD Seq

1. 以下のように試薬を混ぜる。

RAD Seq F(50 µM)	5 µl
RAD Seq R(50 µM)	5 µl
10x Buffer H	3 µl
H2O	17 µl
合計	30 µl

1. 95℃で5分間保温する。
2. ヒートブロックの電源をoffにする。
3. 30℃になるまで、5分おきに温度を記録する。（１分あたり-1℃が目安）
4. エタノール沈殿をする。
5. H₂O 10 µlに溶かす。
6. DNAの定量 (Promega QuantiFluor)を行う。

制限酵素切断

1. DNAの定量 (Promega QuantiFluor)を行う。
2. 以下のように試薬を混ぜる。

DNA	1μg
BamHⅠ	1μl
10x Buffer K	2µl
H2O
合計	20μl

1. 37℃で1時間保温する。
2. エタノール沈殿する。
3. H₂O 10μlに溶かす。
4. DNAを定量する。

アダプター(RAD Seq)の結合

1. 以下のように試薬を混ぜる。

DNA	5μl
RAD Seq	10pmol
T4 DNA Ligase	0.5μl
10x Buffer for T4 DNA Ligase with 10mM ATP	1μl
H2O
合計	10μl

1. 20℃で1時間保温する。
2. 70℃で10分間保温する。
3. 異なるアダプターを加えたサンプルをまとめ、H₂Oを加えて50μlにする。
4. Covarisで超音波断片化する。
5. サイズ分画する。AMPureで精製する。

   • AMPure 80μl
   • RSB 44µl加え、42µl回収

6. End Prep Enzyme Mix 3µl、End Repair Reaction Buffer 5µlを加える。
7. 20℃で30分間保温する。
8. 65℃で30分間保温する。
9. エタノール沈殿する。
10. H₂O 12μlで溶かす。
11. DNAを定量する。

アダプター(Illumina Read2)の結合

1. 以下のように試薬を混ぜる。

DNA	10µl
Illumina Read2	20pmol
T4 DNA Ligase	1μl
10x Buffer for T4 DNA Ligase with 10mM ATP	2μl
H2O
合計	20μl

1. 20℃で1時間保温する。
2. 70℃で10分間保温する。
3. RSB 30µlkを加える。
4. AMPure精製する。サイズ分画する。

   • AMPure 80µl
   • RSB 22μl加え、20µl回収

PCR増幅

1. 以下のように試薬を混ぜる。

DNA	10µl
Universal Primer(10µM)	2.5µl
Index Primer(10µM)	2.5µl
PrimeSTAR HS DNA Polymerase	0.5µl
5x Buffer	10µl
dNTP Mixture	4µl
H2O	20.5µl
合計	50µl

2. 以下の条件でPCR反応を行う。

98℃	30秒
98℃	10秒	x15
65℃	1分15秒
65℃	5分
4℃	∞

3. AMPureで精製する。

• AMPure 50µl
• RSB 32.5µl加え、30µl回収

4. DNAを定量する。

エタノール沈殿

1. 以下の試薬を加え、よく混合する。

3M NaOAc	1/10量
100%EtOH	2.5倍量

1. -20℃に20分間置く。
2. 4℃、15000rpm、15分間遠心。
3. アスピレーターで上清を廃棄する。
4. 半量の70%EtOHを加える。
5. 4℃、15000rpm、5分間遠心。
6. 上清を廃棄。
7. 遠心エバポレーターで2分間乾燥。

サイズ分画

1. AMPureを希釈する。

AMPure XP	60µl
H2O	40µl
合計	100µM

1. 希釈したAMPure 80µlを加え、よく混合する。
2. 室温で5分間静置して、遠心する。
3. 磁性スタンドに立て、上清を回収する。
4. AMPure 15µlを加えて、精製する。

AMPure精製

1. AMPure XPを加える。
2. よく混合して、室温で5分間静置する。
3. 10000rpm、5秒間遠心。
4. 磁性スタンドに立て、2分間静置。
5. 磁性スタンドに立てたまま、マイクロピペットで上清を廃棄する。
6. 70%EtOHを200μl添加する。
7. 室温で30秒間静置、上清を廃棄。
8. 70%EtOHを200μl添加する。
9. 室温で30秒間静置、上清を廃棄。
10. 10000rpm、5秒間遠心。
11. 磁性スタンドに立て、上清を廃棄。
12. 室温で5分間蓋を開けて乾燥させる。
13. Resuspension Buffer(RSB)を添加し、よく混合する。
14. 室温で2分間静置する。10000rpm、５秒間遠心。
15. 磁性スタンドに立て、上清を回収する。