RAD-Seqのライブラリ作成

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−
==アダプターの作成==
+
<!--==実験の手順==
−
====Illumina Read2====
+
#DNAを定量する。
−
  Illumina Read2(50μM) 5μl
+
#制限酵素で切断する。
−
  T4 Polynucleotide Kinase 0.5μl
+
#エタノール沈殿をする。
−
  10x Buffer for T4 DNA Ligase with 10mM ATP 2μl
+
#DNAを定量する。
−
  H<sub>2</sub>O 12μl
+
#アダプター(RAD Seq)を結合する。
−
を混ぜる。
+
#Covarisで断片化する。
 +
#サイズ分画する。
 +
#End Prep Enzyme処理をする。
 +
#エタノール沈殿する。
 +
#DNAの定量をする。
 +
#アダプター(Illumina Read2)を結合する。
 +
#AMPure精製する。
 +
#PCRで増幅する。
 +
#AMPure精製する。
 +
#DNAの定量をする。-->
 +
 
 +
== アダプターの合成 ==
 +
 
 +
  >IlluminaRead2 33mer
 +
GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC
 +
>IlluminaRead2_RT  34mer 3'側が1塩基(T)突出する
 +
  GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
 +
 
 +
  >RADSeqB1_F 31 mer 3'側の4塩基がインデックスになる。
 +
TTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCATA
 +
  >RADSeqB1_R 35mer 5'側が4塩基突出してBamHIの突出末端と相補する。
 +
GATCTATGAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAA
 +
>RADSeqB2_F
 +
TTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTACTT
 +
>RADSeqB2_R
 +
GATCAAGTAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAA
 +
>RADSeqB3_F
 +
TTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTATCC
 +
>RADSeqB3_R
 +
GATCGGATAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAA
 +
>RADSeqB4_F
 +
TTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCTAA
 +
>RADSeqB4_R
 +
GATCTTAGAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAA
 +
 
 +
オリゴDNAはユーロフィンジェノミクス株式会社に注文。
 +
PCRReadyオリゴDNAとして注文(OPC精製、50&micro;M TE溶液)。
 +
 
 +
== アダプターの用意 ==
  
−
#37℃で30分間保温する。
+
=== Illumina Read2 ===
−
#65℃で20分間保温する。
+
Illumina Read2のアダプターはライゲーションのためにリン酸化させる。
  
−
Illumina Read2_RT(50μM) 5μl
+
# 以下のように試薬を混ぜる。
−
10x Buffer H 3μl
+
::{| class="wikitable"
−
H<sub>2</sub>O 2μl
+
|Illumina Read2(50 &micro;M)||style="text-align:right;" |5 µl ||濃度12.5µM
−
を加える。
+
|-
 +
|T4 Polynucleotide Kinase||style="text-align:right;" |0.5 µl
 +
|-
 +
|10x Buffer for T4 DNA Ligase with 10mM ATP||style="text-align:right;" |2 µl
 +
|-
 +
|H<sub>2</sub>O||style="text-align:right;" |12.5 µl
 +
|-
 +
!合計
 +
|style="text-align:right;" |20 µl
 +
|}
 +
# 37℃で30分間保温する。
 +
# 65℃で20分間保温する。
 +
# 以下の試薬を加える。
 +
::{|class="wikitable"
 +
|Illumina Read2_RT(50μM)||style="text-align:right;" |5 µl<!--||濃度8.3µM-->
 +
|-
 +
|10x Buffer H||style="text-align:right;" |3 µl
 +
|-
 +
|H<sub>2</sub>O||style="text-align:right;" |2 µl
 +
|-
 +
!反応液合計
 +
|style="text-align:right;" |30 µl
 +
|}
  
 
#95℃で5分間保温する。
 
#95℃で5分間保温する。
 
#ヒートブロックの電源をoffにする。
 
#ヒートブロックの電源をoffにする。
−
#30℃になるまで、５分おきに温度を記録する。（１分あたり-1℃が目安）
+
#30℃になるまで、5分おきに温度を記録する。（１分あたり-1℃が目安）
 
#エタノール沈殿をする。
 
#エタノール沈殿をする。
−
#H<sub>2</sub>O 10μlに溶かす。
+
#H<sub>2</sub>O 10 µlに溶かす。
 +
#[[DNAの定量 (Promega QuantiFluor)]]を行う。
  
 
====RAD Seq====
 
====RAD Seq====
−
RAD Seq F(50μM) 5μl
+
#以下のように試薬を混ぜる。
−
RAD Seq R(50μM) 5μl
+
::{|class="wikitable"
−
10x Buffer H 3μl
+
|RAD Seq F(50 µM)||style="text-align:right;" |5 µl<!--||濃度8.3µM-->
−
H<sub>2</sub>O 17μl
+
|-
−
を混ぜる。
+
|RAD Seq R(50 µM)||style="text-align:right;" |5 µl<!--||濃度8.3µM-->
 +
|-
 +
|10x Buffer H||style="text-align:right;" |3 µl
 +
|-
 +
|H<sub>2</sub>O||style="text-align:right;" |17 µl
 +
|-
 +
!合計
 +
|style="text-align:right;" |30 µl
 +
|}
 +
 
 
#95℃で5分間保温する。
 
#95℃で5分間保温する。
 
#ヒートブロックの電源をoffにする。
 
#ヒートブロックの電源をoffにする。
−
#30℃になるまで、５分おきに温度を記録する。（１分あたり-1℃が目安）
+
#30℃になるまで、5分おきに温度を記録する。（１分あたり-1℃が目安）
 
#エタノール沈殿をする。
 
#エタノール沈殿をする。
−
#H<sub>2</sub>O 10μlに溶かす。
+
#H<sub>2</sub>O 10 µlに溶かす。
 +
#[[DNAの定量 (Promega QuantiFluor)]]を行う。
 +
 
 +
== ライブラリ作成 ==
 +
=== 制限酵素切断 ===
 +
#以下のように試薬を混ぜる。
 +
::{|class="wikitable"
 +
|DNA||style="text-align:right;" |1 µg<!--||濃度50ng/µl-->
 +
|-
 +
|BamHⅠ||style="text-align:right;" |1 µl
 +
|-
 +
|10x Buffer K||style="text-align:right;" |2 µl
 +
|-
 +
|H<sub>2</sub>O||
 +
|-
 +
!合計
 +
|style="text-align:right;" |20 µl
 +
|}
 +
#37℃で1時間保温する。
 +
#エタノール沈殿する。
 +
#H<sub>2</sub>O 10 µlに溶かす。
 +
#DNAを定量する。
 +
 
 +
==アダプター(RAD Seq)の結合==
 +
#以下のように試薬を混ぜる。
 +
::{|class="wikitable"
 +
|DNA||style="text-align:right;" |5μl
 +
|-
 +
|RAD Seq||style="text-align:right;" |10pmol<!--||最終濃度1µM-->
 +
|-
 +
|T4 DNA Ligase||style="text-align:right;" |0.5μl
 +
|-
 +
|10x Buffer for T4 DNA Ligase with 10mM ATP||style="text-align:right;" |1μl
 +
|-
 +
|H<sub>2</sub>O||
 +
|-
 +
!合計
 +
|style="text-align:right;" |10μl
 +
|}
 +
 
 +
#20℃で1時間保温する。
 +
#70℃で10分間保温する。
 +
#異なるアダプターを加えたサンプルをまとめ、H<sub>2</sub>Oを加えて50μlにする。
 +
#Covarisで超音波断片化する。
 +
#サイズ分画する。<s>AMPureで精製する。
 +
#:*AMPure 80μl</s>
 +
#:*RSB 44µl加え、42µl回収
 +
#End Prep Enzyme Mix 3µl、End Repair Reaction Buffer 5µlを加える。
 +
#20℃で30分間保温する。
 +
#65℃で30分間保温する。
 +
#エタノール沈殿する。
 +
#H<sub>2</sub>O 12μlで溶かす。
 +
#DNAを定量する。
 +
 
 +
==アダプター(Illumina Read2)の結合==
 +
#以下のように試薬を混ぜる。
 +
::{|class="wikitable"
 +
|DNA||style="text-align:right;" |10µl
 +
|-
 +
|Illumina Read2||style="text-align:right;" |20pmol<!--||最終濃度1µM-->
 +
|-
 +
|T4 DNA Ligase||style="text-align:right;" |1μl
 +
|-
 +
|10x Buffer for T4 DNA Ligase with 10mM ATP||style="text-align:right;" |2μl
 +
|-
 +
|H<sub>2</sub>O||
 +
|-
 +
!合計
 +
|style="text-align:right;" |20μl
 +
|}
 +
 
 +
#20℃で1時間保温する。
 +
#70℃で10分間保温する。
 +
#RSB 30µlkを加える。
 +
#AMPure精製する。<s>サイズ分画する。</s>
 +
#:*AMPure 80µl
 +
#:*RSB 22μl加え、20µl回収
 +
 
 +
==PCR増幅==
 +
 
 +
:1. 以下のように試薬を混ぜる。
 +
::{| class="wikitable"
 +
|-
 +
|DNA
 +
|style="text-align:right;" |10µl
 +
|-
 +
|Universal Primer(10µM)||style="text-align:right;" |2.5µl<!--||最終濃度0.5µM-->
 +
|-
 +
|Index Primer(10µM)||style="text-align:right;" |2.5µl<!--||最終濃度0.5µM-->
 +
|-
 +
|PrimeSTAR HS DNA Polymerase||style="text-align:right;" |0.5µl
 +
|-
 +
|5x Buffer||style="text-align:right;" |10µl
 +
|-
 +
|dNTP Mixture||style="text-align:right;" |4µl
 +
|-
 +
|H<sub>2</sub>O||style="text-align:right;" |20.5µl
 +
|-
 +
!合計
 +
|style="text-align:right;" |50µl
 +
|}
 +
:2. 以下の条件でPCR反応を行う。
 +
::{|class="wikitable"
 +
|-
 +
|98℃||30秒
 +
|-
 +
|98℃||10秒||rowspan="2"|x15
 +
|-
 +
|65℃||1分15秒
 +
|-
 +
|65℃||5分
 +
|-
 +
|4℃||∞
 +
|}
 +
 
 +
:3. AMPureで精製する。
 +
::*AMPure 50µl
 +
::*RSB 32.5µl加え、30µl回収
 +
:4. DNAを定量する。
  
 
==エタノール沈殿==
 
==エタノール沈殿==
−
サンプルの1/10量の3M NaOAc
+
#以下の試薬を加え、よく混合する。
−
サンプルの2.5倍量の100% EtOH
+
::{|class="wikitable"
−
を加えて、混合する。
+
|3M NaOAc||1/10量
 +
|-
 +
|100%EtOH||2.5倍量
 +
|}
 
#-20℃に20分間置く。
 
#-20℃に20分間置く。
 
#4℃、15000rpm、15分間遠心。
 
#4℃、15000rpm、15分間遠心。
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#遠心エバポレーターで2分間乾燥。
 
#遠心エバポレーターで2分間乾燥。
  
−
==制限酵素切断==
+
==サイズ分画==
−
DNA 1μg
+
#AMPureを希釈する。
−
BamHⅠ 1μl
+
::{|class="wikitable"
−
10x Buffer K 2μl
+
|AMPure XP||style="text-align:right;" |60µl
−
H<sub>2</sub>O
+
|-
−
合計 20μl
+
|H<sub>2</sub>O||style="text-align:right;" |40µl
−
を混ぜる。
+
|-
−
#37℃で1時間保温する。
+
!合計
−
#エタノール沈殿する。
+
|style="text-align:right;" |100µM
−
#H<sub>2</sub>O 10μlに溶かす。
+
|}
−
 
+
#希釈したAMPure 80µlを加え、よく混合する。
−
==アダプター(RAD Seq)の結合==
+
#室温で5分間静置して、遠心する。
−
DNA 5μl
+
#磁性スタンドに立て、上清を回収する。
−
RAD Seq 10pmol
+
#AMPure 15µlを加えて、精製する。
−
T4 DNA Ligase 0.5μl
+
−
10x Buffer for T4 DNA Ligase with 10mM ATP 1μl
+
−
H<sub>2</sub>O
+
−
合計 10μl
+
−
を混ぜる。
+
−
#20℃で1時間保温する。
+
−
#70℃で10分間保温する。
+
−
#異なるアダプターを加えたサンプルをまとめ、H<sub>2</sub>Oを加えて50μlにする。
+
−
#Covarisで超音波断片化する。
+
  
 
==AMPure精製==
 
==AMPure精製==

2018年11月5日 (月) 16:31時点における最新版


目次

[編集] アダプターの合成 

>IlluminaRead2 33mer
GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC
>IlluminaRead2_RT  34mer 3'側が1塩基(T)突出する
GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

>RADSeqB1_F 31 mer 3'側の4塩基がインデックスになる。
TTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCATA
>RADSeqB1_R 35mer 5'側が4塩基突出してBamHIの突出末端と相補する。
GATCTATGAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAA
>RADSeqB2_F
TTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTACTT
>RADSeqB2_R
GATCAAGTAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAA
>RADSeqB3_F
TTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTATCC
>RADSeqB3_R
GATCGGATAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAA
>RADSeqB4_F
TTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCTAA
>RADSeqB4_R
GATCTTAGAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAA

オリゴDNAはユーロフィンジェノミクス株式会社に注文。 PCRReadyオリゴDNAとして注文(OPC精製、50µM TE溶液)。

[編集] アダプターの用意

[編集] Illumina Read2

Illumina Read2のアダプターはライゲーションのためにリン酸化させる。

  1. 以下のように試薬を混ぜる。
Illumina Read2(50 µM) 5 µl 濃度12.5µM
T4 Polynucleotide Kinase 0.5 µl
10x Buffer for T4 DNA Ligase with 10mM ATP 2 µl
H2O 12.5 µl
合計 20 µl
  1. 37℃で30分間保温する。
  2. 65℃で20分間保温する。
  3. 以下の試薬を加える。
Illumina Read2_RT(50μM) 5 µl
10x Buffer H 3 µl
H2O 2 µl
反応液合計 30 µl
  1. 95℃で5分間保温する。
  2. ヒートブロックの電源をoffにする。
  3. 30℃になるまで、5分おきに温度を記録する。（１分あたり-1℃が目安）
  4. エタノール沈殿をする。
  5. H2O 10 µlに溶かす。
  6. DNAの定量 (Promega QuantiFluor)を行う。

[編集] RAD Seq

  1. 以下のように試薬を混ぜる。
RAD Seq F(50 µM) 5 µl
RAD Seq R(50 µM) 5 µl
10x Buffer H 3 µl
H2O 17 µl
合計 30 µl
  1. 95℃で5分間保温する。
  2. ヒートブロックの電源をoffにする。
  3. 30℃になるまで、5分おきに温度を記録する。（１分あたり-1℃が目安）
  4. エタノール沈殿をする。
  5. H2O 10 µlに溶かす。
  6. DNAの定量 (Promega QuantiFluor)を行う。

[編集] ライブラリ作成

[編集] 制限酵素切断

  1. 以下のように試薬を混ぜる。
DNA 1 µg
BamHⅠ 1 µl
10x Buffer K 2 µl
H2O
合計 20 µl
  1. 37℃で1時間保温する。
  2. エタノール沈殿する。
  3. H2O 10 µlに溶かす。
  4. DNAを定量する。

[編集] アダプター(RAD Seq)の結合

  1. 以下のように試薬を混ぜる。
DNA 5μl
RAD Seq 10pmol
T4 DNA Ligase 0.5μl
10x Buffer for T4 DNA Ligase with 10mM ATP 1μl
H2O
合計 10μl
  1. 20℃で1時間保温する。
  2. 70℃で10分間保温する。
  3. 異なるアダプターを加えたサンプルをまとめ、H2Oを加えて50μlにする。
  4. Covarisで超音波断片化する。
  5. サイズ分画する。AMPureで精製する。
    • AMPure 80μl
    • RSB 44µl加え、42µl回収
  6. End Prep Enzyme Mix 3µl、End Repair Reaction Buffer 5µlを加える。
  7. 20℃で30分間保温する。
  8. 65℃で30分間保温する。
  9. エタノール沈殿する。
  10. H2O 12μlで溶かす。
  11. DNAを定量する。

[編集] アダプター(Illumina Read2)の結合

  1. 以下のように試薬を混ぜる。
DNA 10µl
Illumina Read2 20pmol
T4 DNA Ligase 1μl
10x Buffer for T4 DNA Ligase with 10mM ATP 2μl
H2O
合計 20μl
  1. 20℃で1時間保温する。
  2. 70℃で10分間保温する。
  3. RSB 30µlkを加える。
  4. AMPure精製する。サイズ分画する。
    • AMPure 80µl
    • RSB 22μl加え、20µl回収

[編集] PCR増幅

1. 以下のように試薬を混ぜる。
DNA 10µl
Universal Primer(10µM) 2.5µl
Index Primer(10µM) 2.5µl
PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0.5µl
5x Buffer 10µl
dNTP Mixture 4µl
H2O 20.5µl
合計 50µl
2. 以下の条件でPCR反応を行う。
98℃ 30秒
98℃ 10秒 x15
65℃ 1分15秒
65℃ 5分
4℃ ∞
3. AMPureで精製する。
  • AMPure 50µl
  • RSB 32.5µl加え、30µl回収
4. DNAを定量する。

[編集] エタノール沈殿

  1. 以下の試薬を加え、よく混合する。
3M NaOAc 1/10量
100%EtOH 2.5倍量
  1. -20℃に20分間置く。
  2. 4℃、15000rpm、15分間遠心。
  3. アスピレーターで上清を廃棄する。
  4. 半量の70%EtOHを加える。
  5. 4℃、15000rpm、5分間遠心。
  6. 上清を廃棄。
  7. 遠心エバポレーターで2分間乾燥。

[編集] サイズ分画

  1. AMPureを希釈する。
AMPure XP 60µl
H2O 40µl
合計 100µM
  1. 希釈したAMPure 80µlを加え、よく混合する。
  2. 室温で5分間静置して、遠心する。
  3. 磁性スタンドに立て、上清を回収する。
  4. AMPure 15µlを加えて、精製する。

[編集] AMPure精製

  1. AMPure XPを加える。
  2. よく混合して、室温で5分間静置する。
  3. 10000rpm、5秒間遠心。
  4. 磁性スタンドに立て、2分間静置。
  5. 磁性スタンドに立てたまま、マイクロピペットで上清を廃棄する。
  6. 70%EtOHを200μl添加する。
  7. 室温で30秒間静置、上清を廃棄。
  8. 70%EtOHを200μl添加する。
  9. 室温で30秒間静置、上清を廃棄。
  10. 10000rpm、5秒間遠心。
  11. 磁性スタンドに立て、上清を廃棄。
  12. 室温で5分間蓋を開けて乾燥させる。
  13. Resuspension Buffer(RSB)を添加し、よく混合する。
  14. 室温で2分間静置する。10000rpm、５秒間遠心。
  15. 磁性スタンドに立て、上清を回収する。
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