RAD-Seqのライブラリ作成

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==アダプターの作成==
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<!--==実験の手順==
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====Illumina Read2====
+
#DNAを定量する。
−
#以下のように試薬を混ぜる。
+
#制限酵素で切断する。
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#エタノール沈殿をする。
 +
#DNAを定量する。
 +
#アダプター(RAD Seq)を結合する。
 +
#Covarisで断片化する。
 +
#サイズ分画する。
 +
#End Prep Enzyme処理をする。
 +
#エタノール沈殿する。
 +
#DNAの定量をする。
 +
#アダプター(Illumina Read2)を結合する。
 +
#AMPure精製する。
 +
#PCRで増幅する。
 +
#AMPure精製する。
 +
#DNAの定量をする。-->
 +
 
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== アダプターの合成 ==
 +
 
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>IlluminaRead2 33mer
 +
GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC
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>IlluminaRead2_RT  34mer 3'側が1塩基(T)突出する
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GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
 +
 
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>RADSeqB1_F 31 mer 3'側の4塩基がインデックスになる。
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TTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCATA
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>RADSeqB1_R 35mer 5'側が4塩基突出してBamHIの突出末端と相補する。
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GATCTATGAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAA
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>RADSeqB2_F
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TTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTACTT
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>RADSeqB2_R
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GATCAAGTAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAA
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>RADSeqB3_F
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TTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTATCC
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>RADSeqB3_R
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GATCGGATAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAA
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>RADSeqB4_F
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TTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCTAA
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>RADSeqB4_R
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GATCTTAGAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAA
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オリゴDNAはユーロフィンジェノミクス株式会社に注文。
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PCRReadyオリゴDNAとして注文(OPC精製、50&micro;M TE溶液)。
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== アダプターの用意 ==
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=== Illumina Read2 ===
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Illumina Read2のアダプターはライゲーションのためにリン酸化させる。
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# 以下のように試薬を混ぜる。
 
::{| class="wikitable"
 
::{| class="wikitable"
−
|Illumina Read2(50μM)||5µl<!--||濃度12.5µM-->
+
|Illumina Read2(50 &micro;M)||style="text-align:right;" |5 µl ||濃度12.5µM
 
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|T4 Polynucleotide Kinase||0.5μl
+
|T4 Polynucleotide Kinase||style="text-align:right;" |0.5 µl
 
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|10x Buffer for T4 DNA Ligase with 10mM ATP||2μl
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|10x Buffer for T4 DNA Ligase with 10mM ATP||style="text-align:right;" |2 µl
 
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|H<sub>2</sub>O||12μl
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|H<sub>2</sub>O||style="text-align:right;" |12.5 µl
 
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!合計
 
!合計
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|20μl
+
|style="text-align:right;" |20 µl
 
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# 37℃で30分間保温する。
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#37℃で30分間保温する。
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# 65℃で20分間保温する。
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#65℃で20分間保温する。
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# 以下の試薬を加える。
−
#以下の試薬を加える。
+
 
::{|class="wikitable"
 
::{|class="wikitable"
−
|Illumina Read2_RT(50μM)||5μl<!--||濃度8.3µM-->
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|Illumina Read2_RT(50μM)||style="text-align:right;" |5 µl<!--||濃度8.3µM-->
 
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|10x Buffer H||3μl
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|10x Buffer H||style="text-align:right;" |3 µl
 
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|H<sub>2</sub>O||2μl
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|H<sub>2</sub>O||style="text-align:right;" |2 µl
 
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!合計
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!反応液合計
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|30µl
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|style="text-align:right;" |30 µl
 
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|}
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#95℃で5分間保温する。
 
#95℃で5分間保温する。
 
#ヒートブロックの電源をoffにする。
 
#ヒートブロックの電源をoffにする。
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#30℃になるまで、５分おきに温度を記録する。（１分あたり-1℃が目安）
+
#30℃になるまで、5分おきに温度を記録する。（１分あたり-1℃が目安）
 
#エタノール沈殿をする。
 
#エタノール沈殿をする。
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#H<sub>2</sub>O 10μlに溶かす。
+
#H<sub>2</sub>O 10 µlに溶かす。
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#DNAの定量を行う。
+
#[[DNAの定量 (Promega QuantiFluor)]]を行う。
  
 
====RAD Seq====
 
====RAD Seq====
 
#以下のように試薬を混ぜる。
 
#以下のように試薬を混ぜる。
 
::{|class="wikitable"
 
::{|class="wikitable"
−
|RAD Seq F(50μM)||5μl<!--||濃度8.3µM-->
+
|RAD Seq F(50 µM)||style="text-align:right;" |5 µl<!--||濃度8.3µM-->
 
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|RAD Seq R(50μM)||5μl<!--||濃度8.3µM-->
+
|RAD Seq R(50 µM)||style="text-align:right;" |5 µl<!--||濃度8.3µM-->
 
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|10x Buffer H||3μl
+
|10x Buffer H||style="text-align:right;" |3 µl
 
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|H<sub>2</sub>O||17μl
+
|H<sub>2</sub>O||style="text-align:right;" |17 µl
 
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!合計
 
!合計
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|30µM
+
|style="text-align:right;" |30 µl
 
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#95℃で5分間保温する。
 
#95℃で5分間保温する。
 
#ヒートブロックの電源をoffにする。
 
#ヒートブロックの電源をoffにする。
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#30℃になるまで、５分おきに温度を記録する。（１分あたり-1℃が目安）
+
#30℃になるまで、5分おきに温度を記録する。（１分あたり-1℃が目安）
 
#エタノール沈殿をする。
 
#エタノール沈殿をする。
−
#H<sub>2</sub>O 10μlに溶かす。
+
#H<sub>2</sub>O 10 µlに溶かす。
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#DNAの定量を行う。
+
#[[DNAの定量 (Promega QuantiFluor)]]を行う。
  
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==制限酵素切断==
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== ライブラリ作成 ==
 +
=== 制限酵素切断 ===
 
#以下のように試薬を混ぜる。
 
#以下のように試薬を混ぜる。
 
::{|class="wikitable"
 
::{|class="wikitable"
−
|DNA||1μg<!--||濃度50ng/µl-->
+
|DNA||style="text-align:right;" |1 µg<!--||濃度50ng/µl-->
 
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|BamHⅠ||1μl
+
|BamHⅠ||style="text-align:right;" |1 µl
 
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−
|10x Buffer K||2µl
+
|10x Buffer K||style="text-align:right;" |2 µl
 
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|H<sub>2</sub>O||
 
|H<sub>2</sub>O||
 
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!合計
 
!合計
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|20μl
+
|style="text-align:right;" |20 µl
 
|}
 
|}
 
#37℃で1時間保温する。
 
#37℃で1時間保温する。
 
#エタノール沈殿する。
 
#エタノール沈殿する。
−
#H<sub>2</sub>O 10μlに溶かす。
+
#H<sub>2</sub>O 10 µlに溶かす。
 +
#DNAを定量する。
  
 
==アダプター(RAD Seq)の結合==
 
==アダプター(RAD Seq)の結合==
 
#以下のように試薬を混ぜる。
 
#以下のように試薬を混ぜる。
 
::{|class="wikitable"
 
::{|class="wikitable"
−
|DNA||5μl
+
|DNA||style="text-align:right;" |5μl
 
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|RAD Seq||10pmol<!--||最終濃度1µM-->
+
|RAD Seq||style="text-align:right;" |10pmol<!--||最終濃度1µM-->
 
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|T4 DNA Ligase||0.5μl
+
|T4 DNA Ligase||style="text-align:right;" |0.5μl
 
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|10x Buffer for T4 DNA Ligase with 10mM ATP||1μl
+
|10x Buffer for T4 DNA Ligase with 10mM ATP||style="text-align:right;" |1μl
 
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|H<sub>2</sub>O||
 
|H<sub>2</sub>O||
 
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!合計
 
!合計
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|10μl
+
|style="text-align:right;" |10μl
 
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#エタノール沈殿する。
 
#エタノール沈殿する。
 
#H<sub>2</sub>O 12μlで溶かす。
 
#H<sub>2</sub>O 12μlで溶かす。
 +
#DNAを定量する。
  
 
==アダプター(Illumina Read2)の結合==
 
==アダプター(Illumina Read2)の結合==
 
#以下のように試薬を混ぜる。
 
#以下のように試薬を混ぜる。
 
::{|class="wikitable"
 
::{|class="wikitable"
−
|DNA||10µl
+
|DNA||style="text-align:right;" |10µl
 
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|Illumina Read2||20pmol<!--||最終濃度1µM-->
+
|Illumina Read2||style="text-align:right;" |20pmol<!--||最終濃度1µM-->
 
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|T4 DNA Ligase||1μl
+
|T4 DNA Ligase||style="text-align:right;" |1μl
 
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|10x Buffer for T4 DNA Ligase with 10mM ATP||2μl
+
|10x Buffer for T4 DNA Ligase with 10mM ATP||style="text-align:right;" |2μl
 
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|H<sub>2</sub>O||
 
|H<sub>2</sub>O||
 
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!合計
 
!合計
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|20μl
+
|style="text-align:right;" |20μl
 
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|DNA
 
|DNA
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|10µl
+
|style="text-align:right;" |10µl
 
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|Universal Primer(10µM)||2.5µl<!--||最終濃度0.5µM-->
+
|Universal Primer(10µM)||style="text-align:right;" |2.5µl<!--||最終濃度0.5µM-->
 
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|Index Primer(10µM)||2.5µl<!--||最終濃度0.5µM-->
+
|Index Primer(10µM)||style="text-align:right;" |2.5µl<!--||最終濃度0.5µM-->
 
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|-
−
|PrimeSTAR HS DNA Polymerase||0.5µl
+
|PrimeSTAR HS DNA Polymerase||style="text-align:right;" |0.5µl
 
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|5x Buffer||10µl
+
|5x Buffer||style="text-align:right;" |10µl
 
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−
|dNTP Mixture||4µl
+
|dNTP Mixture||style="text-align:right;" |4µl
 
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|H<sub>2</sub>O||20.5µl
+
|H<sub>2</sub>O||style="text-align:right;" |20.5µl
 
|-
 
|-
 
!合計
 
!合計
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|50µl
+
|style="text-align:right;" |50µl
 
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:2. 以下の条件でPCR反応を行う。
 
:2. 以下の条件でPCR反応を行う。
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::*AMPure 50µl
 
::*AMPure 50µl
 
::*RSB 32.5µl加え、30µl回収
 
::*RSB 32.5µl加え、30µl回収
 +
:4. DNAを定量する。
  
 
==エタノール沈殿==
 
==エタノール沈殿==
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==サイズ分画==
 
==サイズ分画==
−
AMPure XP 60µl
+
#AMPureを希釈する。
−
H<sub>2</sub>O 40µl
+
::{|class="wikitable"
−
を混ぜ、AMPureを希釈する。
+
|AMPure XP||style="text-align:right;" |60µl
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|-
 +
|H<sub>2</sub>O||style="text-align:right;" |40µl
 +
|-
 +
!合計
 +
|style="text-align:right;" |100µM
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|}
 
#希釈したAMPure 80µlを加え、よく混合する。
 
#希釈したAMPure 80µlを加え、よく混合する。
 
#室温で5分間静置して、遠心する。
 
#室温で5分間静置して、遠心する。

2018年11月5日 (月) 16:31時点における最新版


目次

[編集] アダプターの合成 

>IlluminaRead2 33mer
GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC
>IlluminaRead2_RT  34mer 3'側が1塩基(T)突出する
GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

>RADSeqB1_F 31 mer 3'側の4塩基がインデックスになる。
TTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCATA
>RADSeqB1_R 35mer 5'側が4塩基突出してBamHIの突出末端と相補する。
GATCTATGAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAA
>RADSeqB2_F
TTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTACTT
>RADSeqB2_R
GATCAAGTAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAA
>RADSeqB3_F
TTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTATCC
>RADSeqB3_R
GATCGGATAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAA
>RADSeqB4_F
TTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCTAA
>RADSeqB4_R
GATCTTAGAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAA

オリゴDNAはユーロフィンジェノミクス株式会社に注文。 PCRReadyオリゴDNAとして注文(OPC精製、50µM TE溶液)。

[編集] アダプターの用意

[編集] Illumina Read2

Illumina Read2のアダプターはライゲーションのためにリン酸化させる。

  1. 以下のように試薬を混ぜる。
Illumina Read2(50 µM) 5 µl 濃度12.5µM
T4 Polynucleotide Kinase 0.5 µl
10x Buffer for T4 DNA Ligase with 10mM ATP 2 µl
H2O 12.5 µl
合計 20 µl
  1. 37℃で30分間保温する。
  2. 65℃で20分間保温する。
  3. 以下の試薬を加える。
Illumina Read2_RT(50μM) 5 µl
10x Buffer H 3 µl
H2O 2 µl
反応液合計 30 µl
  1. 95℃で5分間保温する。
  2. ヒートブロックの電源をoffにする。
  3. 30℃になるまで、5分おきに温度を記録する。（１分あたり-1℃が目安）
  4. エタノール沈殿をする。
  5. H2O 10 µlに溶かす。
  6. DNAの定量 (Promega QuantiFluor)を行う。

[編集] RAD Seq

  1. 以下のように試薬を混ぜる。
RAD Seq F(50 µM) 5 µl
RAD Seq R(50 µM) 5 µl
10x Buffer H 3 µl
H2O 17 µl
合計 30 µl
  1. 95℃で5分間保温する。
  2. ヒートブロックの電源をoffにする。
  3. 30℃になるまで、5分おきに温度を記録する。（１分あたり-1℃が目安）
  4. エタノール沈殿をする。
  5. H2O 10 µlに溶かす。
  6. DNAの定量 (Promega QuantiFluor)を行う。

[編集] ライブラリ作成

[編集] 制限酵素切断

  1. 以下のように試薬を混ぜる。
DNA 1 µg
BamHⅠ 1 µl
10x Buffer K 2 µl
H2O
合計 20 µl
  1. 37℃で1時間保温する。
  2. エタノール沈殿する。
  3. H2O 10 µlに溶かす。
  4. DNAを定量する。

[編集] アダプター(RAD Seq)の結合

  1. 以下のように試薬を混ぜる。
DNA 5μl
RAD Seq 10pmol
T4 DNA Ligase 0.5μl
10x Buffer for T4 DNA Ligase with 10mM ATP 1μl
H2O
合計 10μl
  1. 20℃で1時間保温する。
  2. 70℃で10分間保温する。
  3. 異なるアダプターを加えたサンプルをまとめ、H2Oを加えて50μlにする。
  4. Covarisで超音波断片化する。
  5. サイズ分画する。AMPureで精製する。
    • AMPure 80μl
    • RSB 44µl加え、42µl回収
  6. End Prep Enzyme Mix 3µl、End Repair Reaction Buffer 5µlを加える。
  7. 20℃で30分間保温する。
  8. 65℃で30分間保温する。
  9. エタノール沈殿する。
  10. H2O 12μlで溶かす。
  11. DNAを定量する。

[編集] アダプター(Illumina Read2)の結合

  1. 以下のように試薬を混ぜる。
DNA 10µl
Illumina Read2 20pmol
T4 DNA Ligase 1μl
10x Buffer for T4 DNA Ligase with 10mM ATP 2μl
H2O
合計 20μl
  1. 20℃で1時間保温する。
  2. 70℃で10分間保温する。
  3. RSB 30µlkを加える。
  4. AMPure精製する。サイズ分画する。
    • AMPure 80µl
    • RSB 22μl加え、20µl回収

[編集] PCR増幅

1. 以下のように試薬を混ぜる。
DNA 10µl
Universal Primer(10µM) 2.5µl
Index Primer(10µM) 2.5µl
PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0.5µl
5x Buffer 10µl
dNTP Mixture 4µl
H2O 20.5µl
合計 50µl
2. 以下の条件でPCR反応を行う。
98℃ 30秒
98℃ 10秒 x15
65℃ 1分15秒
65℃ 5分
4℃ ∞
3. AMPureで精製する。
  • AMPure 50µl
  • RSB 32.5µl加え、30µl回収
4. DNAを定量する。

[編集] エタノール沈殿

  1. 以下の試薬を加え、よく混合する。
3M NaOAc 1/10量
100%EtOH 2.5倍量
  1. -20℃に20分間置く。
  2. 4℃、15000rpm、15分間遠心。
  3. アスピレーターで上清を廃棄する。
  4. 半量の70%EtOHを加える。
  5. 4℃、15000rpm、5分間遠心。
  6. 上清を廃棄。
  7. 遠心エバポレーターで2分間乾燥。

[編集] サイズ分画

  1. AMPureを希釈する。
AMPure XP 60µl
H2O 40µl
合計 100µM
  1. 希釈したAMPure 80µlを加え、よく混合する。
  2. 室温で5分間静置して、遠心する。
  3. 磁性スタンドに立て、上清を回収する。
  4. AMPure 15µlを加えて、精製する。

[編集] AMPure精製

  1. AMPure XPを加える。
  2. よく混合して、室温で5分間静置する。
  3. 10000rpm、5秒間遠心。
  4. 磁性スタンドに立て、2分間静置。
  5. 磁性スタンドに立てたまま、マイクロピペットで上清を廃棄する。
  6. 70%EtOHを200μl添加する。
  7. 室温で30秒間静置、上清を廃棄。
  8. 70%EtOHを200μl添加する。
  9. 室温で30秒間静置、上清を廃棄。
  10. 10000rpm、5秒間遠心。
  11. 磁性スタンドに立て、上清を廃棄。
  12. 室温で5分間蓋を開けて乾燥させる。
  13. Resuspension Buffer(RSB)を添加し、よく混合する。
  14. 室温で2分間静置する。10000rpm、５秒間遠心。
  15. 磁性スタンドに立て、上清を回収する。
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