BigDye Terminaterを使ったシークエンス
提供: 鈴木研Wiki
(版間での差分)
(→Template Quantity for 20μl reaction) |
(→シークエンス) |
||
| (1人の利用者による、間の5版が非表示) | |||
| 41行: | 41行: | ||
|- | |- | ||
|} | |} | ||
| + | |||
== Sequencing Reaction == | == Sequencing Reaction == | ||
| + | === 反応液の組成 === | ||
| + | |||
| + | {| class='wikitable' | ||
| + | |||1サンプル | ||
| + | |- | ||
| + | |BigDye Ready Reaction Premix||1 µl | ||
| + | |- | ||
| + | |BigDye sequencing Buffer||1.5 µl | ||
| + | |- | ||
| + | |プライマー(0.8μM)||終濃度0.16 µM | ||
| + | |- | ||
| + | |Template ||Template Quantity参照 | ||
| + | |- | ||
| + | |滅菌水|| up to 10 µl | ||
| + | |- | ||
| + | |合計||10 µl | ||
| + | |} | ||
| + | |||
| + | === 反応 === | ||
| + | |||
| + | # 96℃ 1分 | ||
| + | # 96℃ 10秒、50℃ 5秒、60℃ 2分、のサイクルを25回 | ||
| + | # 4℃ ∞ | ||
| + | |||
| + | == 精製：エタノール沈殿 == | ||
| − | # | + | # マイクロチューブに<br/>PCR産物 10μl<br/>125mM EDTA 2.5μl<br/>100%エタノール 30μl を加える |
| − | # | + | # -20℃で20分静置 |
| − | # | + | # 15,000rpmで15分遠心 4℃ |
| − | # | + | # アスピレーターで上清を除く |
| − | # | + | # 70%エタノールを 30μl加える |
| − | # | + | # 15,000rpmで5分遠心 4℃ |
| − | # | + | # アスピレーターで上清を除く |
| − | # | + | # Micro-Vac(遠心濃縮機)で1分乾燥 50℃ |
| − | # | + | # HiDiホルムアミド 10μlを加え Vortexsし、サンプルを溶解する<br/>（この状態で冷蔵なら1週間、冷凍なら1ヶまで遮光保存可能） |
| − | # | + | # ヒートブロックで 95℃、2分 |
| − | # | + | # すぐに on ice 5分 |
| − | + | # 遠心して on ice | |
| − | # | + | # シークエンス用96wellプレートに全量入れる |
| − | # | + | |
| − | + | == シークエンス == | |
| − | ** | + | *予め、シーケンサー(2F)の予約をしておく |
| − | * | + | *陰極Bufferは予め室温に戻しておく |
| + | *シークエンスは4サンプルで1RUN、MediumSeqで約45分かかる | ||
| + | *RUN終了後、データ保存に15分程度かかる | ||
2018年11月14日 (水) 14:36時点における最新版
BigDye Terminaterを使ったシークエンス
目次 |
[編集] 試薬
- BigDye Terminator V3.1 Ready Reaction mix
- BigDye Terminator V3.1 5×Sequencing Buffer
- プライマー (0.8μM)
- 125mM EDTA
- 100%エタノール
- 70%エタノール
- HiDi ホルムアミド
[編集] Template Quantity for 20μl reaction
| DNA template | Quantity |
| PCR Product: | |
| ・100-200 bp | 1-3ng |
| ・200-500 bp | 3-10ng |
| ・500-1000 bp | 5-20ng |
| ・1000-2000 bp | 10-40ng |
| ・>2000 bp | 20-50ng |
| Single-stranded DNA | 25-50ng |
| Double-stranded DNA | 150-300ng |
[編集] Sequencing Reaction
[編集] 反応液の組成
| 1サンプル | |
| BigDye Ready Reaction Premix | 1 µl |
| BigDye sequencing Buffer | 1.5 µl |
| プライマー(0.8μM) | 終濃度0.16 µM |
| Template | Template Quantity参照 |
| 滅菌水 | up to 10 µl |
| 合計 | 10 µl |
[編集] 反応
- 96℃ 1分
- 96℃ 10秒、50℃ 5秒、60℃ 2分、のサイクルを25回
- 4℃ ∞
[編集] 精製：エタノール沈殿
- マイクロチューブに
PCR産物 10μl
125mM EDTA 2.5μl
100%エタノール 30μl を加える - -20℃で20分静置
- 15,000rpmで15分遠心 4℃
- アスピレーターで上清を除く
- 70%エタノールを 30μl加える
- 15,000rpmで5分遠心 4℃
- アスピレーターで上清を除く
- Micro-Vac(遠心濃縮機)で1分乾燥 50℃
- HiDiホルムアミド 10μlを加え Vortexsし、サンプルを溶解する
（この状態で冷蔵なら1週間、冷凍なら1ヶまで遮光保存可能） - ヒートブロックで 95℃、2分
- すぐに on ice 5分
- 遠心して on ice
- シークエンス用96wellプレートに全量入れる
[編集] シークエンス
- 予め、シーケンサー(2F)の予約をしておく
- 陰極Bufferは予め室温に戻しておく
- シークエンスは4サンプルで1RUN、MediumSeqで約45分かかる
- RUN終了後、データ保存に15分程度かかる
