LA Taqを使ったPCR
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※注意：LA Taqを使用したPCRの反応液の調製は、必ずon ice(氷の上)で行うこと | ※注意：LA Taqを使用したPCRの反応液の調製は、必ずon ice(氷の上)で行うこと | ||
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| 25mM MgCl2 || style="text-align:right;"| 5 µl|| style="text-align:left;"| (最終濃度：2.5mM) | | 25mM MgCl2 || style="text-align:right;"| 5 µl|| style="text-align:left;"| (最終濃度：2.5mM) | ||
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| − | | | + | | dNTPs (各2.5mM) || style="text-align:right;"| 8 µl|| style="text-align:left;"| |
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| − | | | + | | 10µM プライマー (Sense)|| style="text-align:right;"| 1.25 µl|| style="text-align:left;"| (最終濃度：0.25µM。0.2-1µMの範囲で) |
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| − | | | + | | 10µM プライマー (Anti-sense)|| style="text-align:right;"| 1.25 µl|| style="text-align:left;"| (最終濃度：0.25µM。0.2-1µMの範囲で) |
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| 鋳型DNA|| style="text-align:right;"| 1 µl|| style="text-align:left;"| 基本的に1µl。実験条件により変える | | 鋳型DNA|| style="text-align:right;"| 1 µl|| style="text-align:left;"| 基本的に1µl。実験条件により変える | ||
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|} | |} | ||
# 蓋をしてサーマルサイクラーにいれる。 | # 蓋をしてサーマルサイクラーにいれる。 | ||
| − | # 94℃ 2分 → ( 94℃ 30秒、"アニーリング温度" 30秒、72℃ "1kbにつき1分" ) | + | # 94℃ 2分 → ( 94℃ 30秒、"アニーリング温度" 30秒、72℃ "(伸長反応)1kbにつき1分" ) x 40サイクル → 72℃ 10分 (→ 4℃ ∞)。 |
| − | *" | + | *「アニーリング温度」と「伸長反応の時間」は"プライマー"、"増幅する長さ"によって異なるため、確認する。また、PCRの条件（反応液の組成・反応温度、時間）はノートに記録しておくこと！ |
2019年5月13日 (月) 12:33時点における最新版
[編集] PCRの原理、手順など
PCRの原理、手順などの詳細は、[「MightyAmpを使ったPCR」]へのリンクのページを参照
※注意：LA Taqを使用したPCRの反応液の調製は、必ずon ice(氷の上)で行うこと
[編集] 手順
- 0.2mlチューブ、もしくは8連チューブ、もしくは96ウェルプレートに以下のように混ぜ合わせる。
- プライマーは、"Sense"と"Anti-sense"の2つ入れることを忘れないように。
| 50 µl スケールの場合 | 備考 | |
|---|---|---|
| LA Taq (TaKaRa) | 0.5 µl | |
| 10x LA PCR Buffer ll (Mg2+ free) | 5 µl | |
| 25mM MgCl2 | 5 µl | (最終濃度：2.5mM) |
| dNTPs (各2.5mM) | 8 µl | |
| 10µM プライマー (Sense) | 1.25 µl | (最終濃度：0.25µM。0.2-1µMの範囲で) |
| 10µM プライマー (Anti-sense) | 1.25 µl | (最終濃度：0.25µM。0.2-1µMの範囲で) |
| 鋳型DNA | 1 µl | 基本的に1µl。実験条件により変える |
| 滅菌水 | (up to 50 µl) | 計50µlになるように、滅菌水を入れる |
| 合計 | 50 µl |
- 蓋をしてサーマルサイクラーにいれる。
- 94℃ 2分 → ( 94℃ 30秒、"アニーリング温度" 30秒、72℃ "(伸長反応)1kbにつき1分" ) x 40サイクル → 72℃ 10分 (→ 4℃ ∞)。
- 「アニーリング温度」と「伸長反応の時間」は"プライマー"、"増幅する長さ"によって異なるため、確認する。また、PCRの条件（反応液の組成・反応温度、時間）はノートに記録しておくこと！
