NucleoSpin Gel and PCR Clean-upを使ったDNA精製
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:1. マイクロチューブにPCR産物とPCR産物の2倍量のNT1を加える。 | :1. マイクロチューブにPCR産物とPCR産物の2倍量のNT1を加える。 | ||
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:*このステップを2回行う。 | :*このステップを2回行う。 | ||
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:5. カラムをマイクロチューブにセットする。 | :5. カラムをマイクロチューブにセットする。 | ||
::NE15〜30μlを加え、室温で1分インキュベートする。 | ::NE15〜30μlを加え、室温で1分インキュベートする。 | ||
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| + | ::*電気泳動後のゲルからバンドを切り出して精製する場合は、以下の方法で行う | ||
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| + | :1. 精製したいDNA（PCR産物など）をアガロースゲルで電気泳動する | ||
| + | ::*泳動バッファーは使い回しではなく新しいものを使用 | ||
| + | ::*サンプルをウェルにアプライする時は、各サンプル間で1レーン以上間隔を開ける | ||
| + | ::*電気泳動中は、光が当たらないように箱"Dark電気泳der"を泳動層にかぶせておく | ||
| + | :::※GR Redを取り込んだDNAは光が当たると変異が生じやすいため | ||
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| + | :2. (電気泳動中にヒートブロックを50℃にセットしておく) | ||
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| + | :3. 泳動が終わったら、UV（短波長）を当てて確認しながら、バンド部分のアガロースゲルをカミソリで切り出してエッペンに回収する（＠トランスイルミネーター） | ||
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| + | :4. 3で切り出したアガロースゲル100mg(≒100ul)に対して、NT1 200ulの割合になるようにNT1を加える | ||
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| + | :5. 50度で5-10分熱処理して、ゲルを溶解する（完全に融けるまで） | ||
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| + | （これ以降は、上記の「PCR産物の精製」と同じ） | ||
| + | :6. カラムをCollection Tube(2ml)にセットし、5の溶液をカラムに添加する。 | ||
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| + | ::ろ液を捨て、同じCollection Tubeにカラムをセットする。 | ||
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| + | :7. NT3 700μlをカラムに添加する。 | ||
| + | ::11,000×g で、30秒遠心する。 | ||
| + | ::ろ液を捨て、同じCollection Tubeにカラムをセットする。 | ||
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| + | :8. カラムを11,000×gで、1分遠心しメンブレンを乾燥させる。 | ||
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| + | :9. カラムをマイクロチューブにセットする。 | ||
| + | ::NE15〜30μlを加え、室温で1分インキュベートする。 | ||
| + | ::※溶出時に使うNEの量は、次の操作などによって異なるので、実験前に先生に確認すること (たとえば...PCR産物50μl：30μl , PCR産物20μl：20μl。必ずこの量とは限らない) | ||
::11,000×gで、1分遠心する。 | ::11,000×gで、1分遠心する。 | ||
2019年12月19日 (木) 10:53時点における最新版
[編集] 試薬
- NucleoSpin Gel and PCR Clean-up
- NT1
- NT3(初めに使用する前に、エタノールを加える）
- NE
- PCR産物
[編集] 実験方法（PCR産物の精製）
- 1. マイクロチューブにPCR産物とPCR産物の2倍量のNT1を加える。
- 2. カラムをCollection Tube(2ml)にセットし、1の溶液をカラムに添加する。
- 11,000×g で、30秒遠心する。
- ろ液を捨て、同じCollection Tubeにカラムをセットする。
- 3. NT3 700μlをカラムに添加する。
- 11,000×g で、30秒遠心する。
- ろ液を捨て、同じCollection Tubeにカラムをセットする。
- このステップを2回行う。
- 4. カラムを11,000×gで、1分遠心しメンブレンを乾燥させる。
- 5. カラムをマイクロチューブにセットする。
- NE15〜30μlを加え、室温で1分インキュベートする。
- ※溶出時に使うNEの量は、次の操作などによって異なるので、実験前に先生に確認すること (たとえば...PCR産物50μl：30μl , PCR産物20μl：20μl。必ずこの量とは限らない)
- 11,000×gで、1分遠心する。
[編集] 実験方法（電気泳動後のゲルから抽出する場合）
- 電気泳動後のゲルからバンドを切り出して精製する場合は、以下の方法で行う
- 1. 精製したいDNA（PCR産物など）をアガロースゲルで電気泳動する
- 泳動バッファーは使い回しではなく新しいものを使用
- サンプルをウェルにアプライする時は、各サンプル間で1レーン以上間隔を開ける
- 電気泳動中は、光が当たらないように箱"Dark電気泳der"を泳動層にかぶせておく
- ※GR Redを取り込んだDNAは光が当たると変異が生じやすいため
- 2. (電気泳動中にヒートブロックを50℃にセットしておく)
- 3. 泳動が終わったら、UV（短波長）を当てて確認しながら、バンド部分のアガロースゲルをカミソリで切り出してエッペンに回収する（＠トランスイルミネーター）
- 4. 3で切り出したアガロースゲル100mg(≒100ul)に対して、NT1 200ulの割合になるようにNT1を加える
- 5. 50度で5-10分熱処理して、ゲルを溶解する（完全に融けるまで）
（これ以降は、上記の「PCR産物の精製」と同じ）
- 6. カラムをCollection Tube(2ml)にセットし、5の溶液をカラムに添加する。
- 11,000×g で、30秒遠心する。
- ろ液を捨て、同じCollection Tubeにカラムをセットする。
- 7. NT3 700μlをカラムに添加する。
- 11,000×g で、30秒遠心する。
- ろ液を捨て、同じCollection Tubeにカラムをセットする。
- このステップを2回行う。
- 8. カラムを11,000×gで、1分遠心しメンブレンを乾燥させる。
- 9. カラムをマイクロチューブにセットする。
- NE15〜30μlを加え、室温で1分インキュベートする。
- ※溶出時に使うNEの量は、次の操作などによって異なるので、実験前に先生に確認すること (たとえば...PCR産物50μl：30μl , PCR産物20μl：20μl。必ずこの量とは限らない)
- 11,000×gで、1分遠心する。
