NucleoSpin Gel and PCR Clean-upを使ったDNA精製

2019年12月19日 (木) 10:53時点における最新版

[編集] 試薬

• NucleoSpin Gel and PCR Clean-up

NT1

NT3(初めに使用する前に、エタノールを加える）

NE

• PCR産物

[編集] 実験方法（PCR産物の精製）

1. マイクロチューブにPCR産物とPCR産物の2倍量のNT1を加える。

2. カラムをCollection Tube(2ml)にセットし、1の溶液をカラムに添加する。

11,000×g で、30秒遠心する。

ろ液を捨て、同じCollection Tubeにカラムをセットする。

3. NT3 700μlをカラムに添加する。

11,000×g で、30秒遠心する。

ろ液を捨て、同じCollection Tubeにカラムをセットする。

• このステップを2回行う。

4. カラムを11,000×gで、1分遠心しメンブレンを乾燥させる。

5. カラムをマイクロチューブにセットする。

NE15〜30μlを加え、室温で1分インキュベートする。

※溶出時に使うNEの量は、次の操作などによって異なるので、実験前に先生に確認すること　(たとえば...PCR産物50μl：30μl , PCR産物20μl：20μl。必ずこの量とは限らない)

11,000×gで、1分遠心する。

[編集] 実験方法（電気泳動後のゲルから抽出する場合）

• 電気泳動後のゲルからバンドを切り出して精製する場合は、以下の方法で行う

1. 精製したいDNA（PCR産物など）をアガロースゲルで電気泳動する

• 泳動バッファーは使い回しではなく新しいものを使用
• サンプルをウェルにアプライする時は、各サンプル間で1レーン以上間隔を開ける
• 電気泳動中は、光が当たらないように箱"Dark電気泳der"を泳動層にかぶせておく

※GR Redを取り込んだDNAは光が当たると変異が生じやすいため

2. (電気泳動中にヒートブロックを50℃にセットしておく)

3. 泳動が終わったら、UV（短波長）を当てて確認しながら、バンド部分のアガロースゲルをカミソリで切り出してエッペンに回収する（＠トランスイルミネーター）

4. 3で切り出したアガロースゲル100mg(≒100ul)に対して、NT1 200ulの割合になるようにNT1を加える

5. 50度で5-10分熱処理して、ゲルを溶解する（完全に融けるまで）

（これ以降は、上記の「PCR産物の精製」と同じ）

6. カラムをCollection Tube(2ml)にセットし、5の溶液をカラムに添加する。

11,000×g で、30秒遠心する。

ろ液を捨て、同じCollection Tubeにカラムをセットする。

7. NT3 700μlをカラムに添加する。

11,000×g で、30秒遠心する。

ろ液を捨て、同じCollection Tubeにカラムをセットする。

• このステップを2回行う。

8. カラムを11,000×gで、1分遠心しメンブレンを乾燥させる。

9. カラムをマイクロチューブにセットする。

NE15〜30μlを加え、室温で1分インキュベートする。

※溶出時に使うNEの量は、次の操作などによって異なるので、実験前に先生に確認すること　(たとえば...PCR産物50μl：30μl , PCR産物20μl：20μl。必ずこの量とは限らない)

11,000×gで、1分遠心する。