TAクローニング
提供: 鈴木研Wiki
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====(1) PCR産物の調製==== | ====(1) PCR産物の調製==== | ||
| − | *精製したPCR産物を用いる場合、以下の要領で調製する。 | + | *精製したPCR産物を用いる場合、以下の要領で調製する。 (計 9 µl) |
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!!! 添加量 !! 終濃度 | !!! 添加量 !! 終濃度 | ||
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| 2mM dNTPs || style="text-align:right;"| 0.9 µl || | 0.2mM (10倍希釈) | | 2mM dNTPs || style="text-align:right;"| 0.9 µl || | 0.2mM (10倍希釈) | ||
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| + | ====(2) 3'末端のdA付加反応==== | ||
| + | :1. (1)で調製したPCR産物（9 µl）に「10x A-attachment Mix」1 µl を添加してよく混ぜる。 | ||
| + | :2. 60℃で10分間反応させる。 | ||
| + | :3. 次のライゲーションの直前まで、氷上（あるいは、4℃）に置く | ||
| + | ::*dA付加反応後は、すぐに次のライゲーションを行う （この反応で形成した3'突出末端は不安定なため、ライゲーション前で放置しない） | ||
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| − | + | :1. 以下の要領で、ライゲーション反応液を調製する。（計10µl） | |
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| + | | 2x Ligation Buffer || style="text-align:right;"| 5 µl || | -20℃から出して溶解したら、すぐに氷上に置くこと | ||
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| + | | pTA2 vector (50ng/µl, 3kb)|| style="text-align:right;"|1 µl || | -20℃から出して溶解したら、すぐに氷上に置くこと | ||
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| + | | (2)でdA付加したPCR産物 || style="text-align:right;"| 3 µl|| | (モル換算で)vectorの3倍以上の量になるとよい | ||
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| + | | T4 DNA Ligase || style="text-align:right;"| 1 µl|| | 氷上に置く（orクーラーボックスを使う） | ||
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2020年2月19日 (水) 16:45時点における版
目次 |
使用するキット
- 「TArget Clone -Plus-」 (Toyobo) ＠-20℃フリーザー
実験方法
(1) PCR産物の調製
- 精製したPCR産物を用いる場合、以下の要領で調製する。 (計 9 µl)
添加量 終濃度 精製PCR産物 5 µl - dH2O 1.66 µl - KOD -Plus- 10x Buffer 0.9 µl 1x (10倍希釈) 25mM MgSO4 0.54 µl 1.5mM (16.6倍希釈) 2mM dNTPs 0.9 µl 0.2mM (10倍希釈)
(2) 3'末端のdA付加反応
- 1. (1)で調製したPCR産物（9 µl）に「10x A-attachment Mix」1 µl を添加してよく混ぜる。
- 2. 60℃で10分間反応させる。
- 3. 次のライゲーションの直前まで、氷上（あるいは、4℃）に置く
- dA付加反応後は、すぐに次のライゲーションを行う （この反応で形成した3'突出末端は不安定なため、ライゲーション前で放置しない）
(3) ライゲーション
- 1. 以下の要領で、ライゲーション反応液を調製する。（計10µl）
添加量 備考 2x Ligation Buffer 5 µl -20℃から出して溶解したら、すぐに氷上に置くこと pTA2 vector (50ng/µl, 3kb) 1 µl -20℃から出して溶解したら、すぐに氷上に置くこと (2)でdA付加したPCR産物 3 µl (モル換算で)vectorの3倍以上の量になるとよい T4 DNA Ligase 1 µl 氷上に置く（orクーラーボックスを使う）
- 2. 16℃で30分以上反応させる。
