TAクローニング
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| + | | <b>精製PCR産物</b> || style="text-align:right;"| 5 µl || | - || | - | ||
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| + | | dH2O|| style="text-align:right;"|1.66 µl || | - || | - | ||
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| + | | KOD -Plus- 10x Buffer || style="text-align:right;"| 0.9 µl|| | 1x (10倍希釈) || | KOD -Plus- の付属品 | ||
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| + | | 25mM MgSO4 || style="text-align:right;"| 0.54 µl|| | 1.5mM (16.6倍希釈) || | KOD -Plus- の付属品 | ||
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| + | | 2mM dNTPs || style="text-align:right;"| 0.9 µl || | 0.2mM (10倍希釈) || | KOD -Plus- の付属品 | ||
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| − | : | + | ====(2) 3'末端のdA付加反応==== |
| + | :1. (1)で調製したPCR産物（9 µl）に「10x A-attachment Mix」1 µl を添加してよく混ぜる。 | ||
| + | :2. 60℃で10分間反応させる。 ※30分まで延長可能 | ||
| + | :3. 次のライゲーションの直前まで、氷上（あるいは、4℃）に置く | ||
| + | ::*dA付加反応後は、すぐに次のライゲーションを行う （この反応で形成した3'突出末端は不安定なため、ライゲーション前で放置しない） | ||
| − | + | ====(3) ライゲーション==== | |
| − | + | :1. 以下の要領で、ライゲーション反応液を調製する。（計10µl） | |
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| + | | 2x Ligation Buffer || style="text-align:right;"| 5 µl || | -20℃から出して溶解したら、すぐに氷上に置くこと | ||
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| + | | pTA2 vector (50ng/µl, 3kb)|| style="text-align:right;"|1 µl || | -20℃から出して溶解したら、すぐに氷上に置くこと | ||
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| + | | <b>(2)でdA付加したPCR産物</b> || style="text-align:right;"| 3 µl|| | (モル換算で)vectorの3倍以上の量になるとよい | ||
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| + | | T4 DNA Ligase || style="text-align:right;"| 1 µl|| | 氷上に置く（orクーラーボックスを使う） | ||
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| − | : | + | :2. 16℃で30分以上反応させる。 |
| − | : | + | ====(4) 大腸菌DH5αの形質転換==== |
| − | : | + | :あとは、ライゲーション産物を用いて大腸菌DH5αのコンピテントセルを形質転換する |
| − | : | + | :*選抜用の抗生物質は、アンピシリン（50mg/l）を使う |
| − | :: | + | :*インサートの有無をチェックできるように、大腸菌をプレートに撒く前に、X-Gal (2%)、IPTG (0.1M)をプレート1枚につき20μlずつ塗布する |
| + | ::*インサートが入ったコロニーは白色、インサートが入らなかったコロニーは青色になる （青白判定） | ||
2020年3月10日 (火) 14:22時点における最新版
目次 |
[編集] 使用するキット
- 「TArget Clone -Plus-」 (Toyobo) ＠フリーザー（-20℃）
[編集] 実験方法
[編集] (1) PCR産物の調製
- 精製したPCR産物を用いる場合、以下の要領で調製する。 (計 9 µl)
添加量 終濃度 備考 精製PCR産物 5 µl - - dH2O 1.66 µl - - KOD -Plus- 10x Buffer 0.9 µl 1x (10倍希釈) KOD -Plus- の付属品 25mM MgSO4 0.54 µl 1.5mM (16.6倍希釈) KOD -Plus- の付属品 2mM dNTPs 0.9 µl 0.2mM (10倍希釈) KOD -Plus- の付属品
[編集] (2) 3'末端のdA付加反応
- 1. (1)で調製したPCR産物（9 µl）に「10x A-attachment Mix」1 µl を添加してよく混ぜる。
- 2. 60℃で10分間反応させる。 ※30分まで延長可能
- 3. 次のライゲーションの直前まで、氷上（あるいは、4℃）に置く
- dA付加反応後は、すぐに次のライゲーションを行う （この反応で形成した3'突出末端は不安定なため、ライゲーション前で放置しない）
[編集] (3) ライゲーション
- 1. 以下の要領で、ライゲーション反応液を調製する。（計10µl）
添加量 備考 2x Ligation Buffer 5 µl -20℃から出して溶解したら、すぐに氷上に置くこと pTA2 vector (50ng/µl, 3kb) 1 µl -20℃から出して溶解したら、すぐに氷上に置くこと (2)でdA付加したPCR産物 3 µl (モル換算で)vectorの3倍以上の量になるとよい T4 DNA Ligase 1 µl 氷上に置く（orクーラーボックスを使う）
- 2. 16℃で30分以上反応させる。
[編集] (4) 大腸菌DH5αの形質転換
- あとは、ライゲーション産物を用いて大腸菌DH5αのコンピテントセルを形質転換する
- 選抜用の抗生物質は、アンピシリン（50mg/l）を使う
- インサートの有無をチェックできるように、大腸菌をプレートに撒く前に、X-Gal (2%)、IPTG (0.1M)をプレート1枚につき20μlずつ塗布する
- インサートが入ったコロニーは白色、インサートが入らなかったコロニーは青色になる （青白判定）
