In-Fusion Cloning
提供: 鈴木研Wiki
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2020年10月7日 (水) 16:09時点における版
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使用するキット
- 「In-Fusion HD Cloning Kit」 (TaKaRa: Clontech) ＠フリーザー（-20℃）
実験方法
(1) PCR産物の前処理
- 下記の(a)(b)いずれかの方法でPCR産物の前処理を行う
- (a) カラムでの精製 （ベクターを制限酵素処理した場合も同様）
⇒ NucleoSpin Gel and PCR Clean-upを使ったDNA精製 を参照
- (b) Cloning Enhancer処理
- PCR後の電気泳動での確認時に、非特異的なバンドがなかった場合、この方法を用いることが可能
- 1. 以下の要領で、反応液を調製する。（計7µl）
添加量 PCR産物 5 µl Cloning Enhancer 2 µl
- 2. 「37℃で30分 → 80℃で20分」反応させる。
(2) In-Fusion Cloning
- 1. 以下の要領で、反応液を調製する。（計5µl）
添加量 備考 dH2O Z µl Z = 4-(X+Y) 線状化ベクター X µl 基本：2 µl。25-100ng分 インサートのPCR産物 Y µl 基本：2 µl。25-100ng分。※(1)でCloning Enhancer処理したものは、インサート・ベクター合わせて2 µlまで 5x In-Fusion HD enzyme Premix 1 µl
- 2. 16℃で30分以上反応させる。
(4) 大腸菌DH5αの形質転換
- あとは、ライゲーション産物を用いて大腸菌DH5αのコンピテントセルを形質転換する
- 選抜用の抗生物質は、アンピシリン（50mg/l）を使う
- インサートの有無をチェックできるように、大腸菌をプレートに撒く前に、X-Gal (2%)、IPTG (0.1M)をプレート1枚につき20μlずつ塗布する
- インサートが入ったコロニーは白色、インサートが入らなかったコロニーは青色になる （青白判定）
