TruSeq Nano DNA Library Prep Kit
提供: 鈴木研Wiki
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# Covaris S2で断片化する。 | # Covaris S2で断片化する。 | ||
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| Cycles per Burst || colspan='2' | 200 | | Cycles per Burst || colspan='2' | 200 | ||
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| Mode || colspan='2' | Frequency sweeping | | Mode || colspan='2' | Frequency sweeping | ||
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=== 末端整形 (約0.5時間) === | === 末端整形 (約0.5時間) === | ||
| − | # 20 µl End Repair Mixを加える(標準プロトコール40µlの半分)。10回ピペッティングで混ぜる。初めて使用するときはEnd Repair | + | # 20 µl End Repair Mixを加える(標準プロトコール40µlの半分)。10回ピペッティングで混ぜる。初めて使用するときはEnd Repair Mixを200 µlずつ小分けする。 |
# 30℃で30分間、インキュベートする。 | # 30℃で30分間、インキュベートする。 | ||
2016年4月14日 (木) 12:32時点における最新版
目次 |
[編集] 手順
Illuminaのプロトコールでは温度制御は全てサーマルサイクラーを使用するように書いてあるが、ヒートブロックを二つほど用意すればPCR増幅以外はできる。
[編集] DNA断片化 (約1時間)
- DNA 100 - 200 ng / 52.5 µl に調整する。
- Covaris S2で断片化する。
| DNAの長さ(目標) | 350bp | 550 bp |
| Duty Cycle | 10% | |
| Intensity | 5 | 2 |
| Cycles per Burst | 200 | |
| Time (duration) | 45 | |
| Mode | Frequency sweeping | |
- DNA溶液 50 µl を回収する。
[編集] DNA精製
- Sample Purification Beads を80 µl加える。よく撹拌して、5分間室温で放置する。
- 遠心後、磁性スタンドに立て、上清を捨てる。
- 200 µl 80%エタノールを加え、30秒後、上清を捨てる。スタンドから外して混ぜたりする必要はない。2回行う。
- 遠心して上清を捨てたあと、5分間乾燥させる。
- 31 µl Resuspension Bufferを加え、懸濁する。2分室温で放置する。RSBは標準プロトコール(62.5µl)の半量になっている。
- 遠心後、磁性スタンドに立て、上清 30 µl を回収する。
[編集] 末端整形 (約0.5時間)
- 20 µl End Repair Mixを加える(標準プロトコール40µlの半分)。10回ピペッティングで混ぜる。初めて使用するときはEnd Repair Mixを200 µlずつ小分けする。
- 30℃で30分間、インキュベートする。
[編集] サイズ分画 (約0.5時間)
- Sample Purification Beadsと水を以下のように混ぜる。
- DNAの長さ350bpのとき、Sample Purification Beads 60 µl、水 40 µl
- DNAの長さ550bpのとき、Sample Purification Beads 50 µl、水 50 µl
- 希釈したSample Purification Beads 80 µl(標準プロトコール160µlの半分)を加え、よく撹拌して、5分間室温で放置する。
- 遠心後、磁性スタンドに立て、上清を回収する。
- Sample Purification Beads 15 µl(標準プロトコール30µlの半分)を加え、よく撹拌して、5分間室温で放置する。
- 遠心して上清を捨てる。
- 200 µl 80%エタノールを加え、30秒後、上清を捨てる。スタンドから外して混ぜたりする必要はない。2回行う。
- 遠心して上清を捨てたあと、5分間乾燥させる。
- 20 µl Resuspension Bufferを加え、懸濁する。2分室温で放置する。
- 上清 17.5 µl を回収する。ここで止められる(-20℃)。
[編集] 3'アデニル化 (約0.5時間)
- 12.5 µl A-Tailing Mixを加える。10回ピペッティングで混ぜる。初めて使用するときはA-Tailing Mixを100 µlずつ小分けする。
- 37℃で30分間、インキュベートする。
- 70℃で5分間、インキュベートする。
- 4℃にする。
[編集] アダプターのライゲーション (約1時間)
- 2.5 µl Ligase Mix、Resuspension Bufferを 2.5 µl、2.5µl Adapter Indexを加える。10回ピペッティングで混ぜる。
- 30℃で10分間、インキュベートする。
- 5µl Stop Ligase Mixを加える。10回ピペッティングで混ぜる。
- Sample Purification Beads (42.5 µl)を加え、精製する(上のDNA精製と同じ)。52.5 µl RSBを加え、50 µl 回収する。ここで止められる(-20℃)。
- Sample Purification Beads (50 µl)を加え、もう一度精製する。27.5 µl RSBを加え、25 µl をPCR用のチューブへ回収する。
[編集] PCR (約1.5時間)
- 5 µl PCR Primer Cocktailを加える。25 µl PCR Master Mixを加える。初めて使用するときはPCR Master Mixを200 µlずつ小分けする。
- 95℃で3分、(98℃で20秒、60℃で15秒、72℃で30秒) x 8 cycle、72℃で5分、のPCRを行う。
- Sample Purification Beads (50 µl)を加え、精製する。32.5 µl RSBを加え、30 µl 回収する。ここで止められる(-20℃)。
[編集] 定量
- Promega社のQuantiFluor™ dsDNA Systemなどで定量する(ng/µl)。
