TruSeq Nano DNA Library Prep Kit

2016年4月14日 (木) 12:32時点における最新版

[編集] 手順

Illuminaのプロトコールでは温度制御は全てサーマルサイクラーを使用するように書いてあるが、ヒートブロックを二つほど用意すればPCR増幅以外はできる。

[編集] DNA断片化 (約1時間)

1. DNA 100 - 200 ng / 52.5 µl に調整する。
2. Covaris S2で断片化する。

1. DNA溶液 50 µl を回収する。

[編集] DNA精製

1. Sample Purification Beads を80 µl加える。よく撹拌して、5分間室温で放置する。
2. 遠心後、磁性スタンドに立て、上清を捨てる。
3. 200 µl 80%エタノールを加え、30秒後、上清を捨てる。スタンドから外して混ぜたりする必要はない。2回行う。
4. 遠心して上清を捨てたあと、5分間乾燥させる。
5. 31 µl Resuspension Bufferを加え、懸濁する。2分室温で放置する。RSBは標準プロトコール(62.5µl)の半量になっている。
6. 遠心後、磁性スタンドに立て、上清 30 µl を回収する。

[編集] 末端整形 (約0.5時間)

1. 20 µl End Repair Mixを加える(標準プロトコール40µlの半分)。10回ピペッティングで混ぜる。初めて使用するときはEnd Repair Mixを200 µlずつ小分けする。
2. 30℃で30分間、インキュベートする。

[編集] サイズ分画 (約0.5時間)

1. Sample Purification Beadsと水を以下のように混ぜる。
   1. DNAの長さ350bpのとき、Sample Purification Beads 60 µl、水 40 µl
   2. DNAの長さ550bpのとき、Sample Purification Beads 50 µl、水 50 µl
2. 希釈したSample Purification Beads 80 µl(標準プロトコール160µlの半分)を加え、よく撹拌して、5分間室温で放置する。
3. 遠心後、磁性スタンドに立て、上清を回収する。
4. Sample Purification Beads 15 µl(標準プロトコール30µlの半分)を加え、よく撹拌して、5分間室温で放置する。
5. 遠心して上清を捨てる。
6. 200 µl 80%エタノールを加え、30秒後、上清を捨てる。スタンドから外して混ぜたりする必要はない。2回行う。
7. 遠心して上清を捨てたあと、5分間乾燥させる。
8. 20 µl Resuspension Bufferを加え、懸濁する。2分室温で放置する。
9. 上清 17.5 µl を回収する。ここで止められる(-20℃)。

[編集] 3'アデニル化 (約0.5時間)

1. 12.5 µl A-Tailing Mixを加える。10回ピペッティングで混ぜる。初めて使用するときはA-Tailing Mixを100 µlずつ小分けする。
2. 37℃で30分間、インキュベートする。
3. 70℃で5分間、インキュベートする。
4. 4℃にする。

[編集] アダプターのライゲーション (約1時間)

1. 2.5 µl Ligase Mix、Resuspension Bufferを 2.5 µl、2.5µl Adapter Indexを加える。10回ピペッティングで混ぜる。
2. 30℃で10分間、インキュベートする。
3. 5µl Stop Ligase Mixを加える。10回ピペッティングで混ぜる。
4. Sample Purification Beads (42.5 µl)を加え、精製する(上のDNA精製と同じ)。52.5 µl RSBを加え、50 µl 回収する。ここで止められる(-20℃)。
5. Sample Purification Beads (50 µl)を加え、もう一度精製する。27.5 µl RSBを加え、25 µl をPCR用のチューブへ回収する。

[編集] PCR (約1.5時間)

1. 5 µl PCR Primer Cocktailを加える。25 µl PCR Master Mixを加える。初めて使用するときはPCR Master Mixを200 µlずつ小分けする。
2. 95℃で3分、(98℃で20秒、60℃で15秒、72℃で30秒) x 8 cycle、72℃で5分、のPCRを行う。
3. Sample Purification Beads (50 µl)を加え、精製する。32.5 µl RSBを加え、30 µl 回収する。ここで止められる(-20℃)。

[編集] 定量

Promega社のQuantiFluor™ dsDNA Systemなどで定量する(ng/µl)。

[編集] 参考資料

ファイル:Truseq-nano-dna-library-prep-guide-15041110-c.pdf