In-Fusion Cloning
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| − | | | + | | PCR産物 || style="text-align:right;"| 5 µl |
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| Cloning Enhancer|| style="text-align:right;"|2 µl | | Cloning Enhancer|| style="text-align:right;"|2 µl | ||
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| 線状化ベクター || style="text-align:right;"| X µl || | 基本：2 µl。25-100ng分 | | 線状化ベクター || style="text-align:right;"| X µl || | 基本：2 µl。25-100ng分 | ||
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| − | | | + | | 前処理したインサートのPCR産物 || style="text-align:right;"|Y µl || | 基本：2 µl。25-100ng分。※(1)でCloning Enhancer処理したものは、インサート・ベクター合わせて2 µlまで |
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| 5x In-Fusion HD enzyme Premix || style="text-align:right;"| 1 µl|| | | | 5x In-Fusion HD enzyme Premix || style="text-align:right;"| 1 µl|| | | ||
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:2. 「50℃で30分」反応させた後に、氷上に置く。 | :2. 「50℃で30分」反応させた後に、氷上に置く。 | ||
| − | ====( | + | ====(3) 大腸菌DH5αの形質転換==== |
:あとは、In-Fusion Cloning産物を用いて大腸菌DH5αのコンピテントセルを形質転換する | :あとは、In-Fusion Cloning産物を用いて大腸菌DH5αのコンピテントセルを形質転換する | ||
| + | ⇒ [[大腸菌DH5aの形質転換]] を参照 | ||
2020年10月19日 (月) 12:01時点における最新版
[編集] 使用するキット
- 「In-Fusion HD Cloning Kit」 (TaKaRa: Clontech) ＠フリーザー（-20℃）
[編集] 実験方法
[編集] (1) PCR産物の前処理
- 下記の(a)(b)いずれかの方法でPCR産物の前処理を行う
- (a) カラムでの精製 （ベクターを制限酵素処理した場合も同様）
⇒ NucleoSpin Gel and PCR Clean-upを使ったDNA精製 を参照
- (b) Cloning Enhancer処理
- PCR後の電気泳動での確認時に、非特異的なバンドがなかった場合、この方法を用いることが可能
- 1. 以下の要領で、反応液を調製する。（計7µl）
添加量 PCR産物 5 µl Cloning Enhancer 2 µl
- 2. 「37℃で30分 → 80℃で20分」反応させる。
[編集] (2) In-Fusion Cloning
- 1. 以下の要領で、反応液を調製する。（計5µl）
添加量 備考 dH2O Z µl Z = 4-(X+Y) 線状化ベクター X µl 基本：2 µl。25-100ng分 前処理したインサートのPCR産物 Y µl 基本：2 µl。25-100ng分。※(1)でCloning Enhancer処理したものは、インサート・ベクター合わせて2 µlまで 5x In-Fusion HD enzyme Premix 1 µl
- 2. 「50℃で30分」反応させた後に、氷上に置く。
[編集] (3) 大腸菌DH5αの形質転換
- あとは、In-Fusion Cloning産物を用いて大腸菌DH5αのコンピテントセルを形質転換する
⇒ 大腸菌DH5aの形質転換 を参照
