長いPCR産物のライブラリ作成
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(ページの作成:「== PCR産物の断片化== #PCR産物約10 µg/50 µlをCovarisのチューブにいれる。 # 以下の条件でCovaris S2で断片化する {| class='wikitabl...」) |
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== PCR産物の断片化== | == PCR産物の断片化== | ||
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# 以下の条件でCovaris S2で断片化する | # 以下の条件でCovaris S2で断片化する | ||
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|+ Covarisの設定 | |+ Covarisの設定 | ||
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| − | | DNAの長さ(目標) || 350bp | + | | DNAの長さ(目標) |
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| − | | Duty Cycle || 10% | + | | Duty Cycle |
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| − | + | == 末端の修復 End Repair == | |
| − | + | === NEBNext End Repair Module を使用 === | |
| − | + | * 以下のように試薬を混ぜる | |
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|PCR 産物 | |PCR 産物 | ||
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| − | | | + | |NEBNext End Repair Reaction Buffer |
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| − | | | + | |NEBNext End Repair Enzyme Mix |
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| − | + | * 20℃で30分間保温する。 | |
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| − | == | + | == AMPureによる精製 == |
| − | # | + | # Sample Purification Beadsと水を以下のように混ぜる。 |
| − | + | ## DNAの長さ350bpのとき、Sample Purification Beads 60 µl、水 40 µl | |
| − | + | # 希釈したSample Purification Beads 80 µlを加え、よく撹拌して、5分間室温で放置する。 | |
| − | + | # 遠心後、磁性スタンドに立て、上清を'''回収'''する。 | |
| − | + | # Sample Purification Beads 15 µlを加え、よく撹拌して、5分間室温で放置する。 | |
| − | + | # 遠心して上清を捨てる。 | |
| − | + | # 200 µl 80%エタノールを加え、30秒後、上清を捨てる。スタンドから外して混ぜたりする必要はない。2回行う。 | |
| − | + | # 遠心して上清を捨てたあと、5分間乾燥させる。 | |
| − | + | # 20 µl Resuspension Bufferを加え、懸濁する。2分室温で放置する。 | |
| − | + | # 上清 17.5 µl を回収する。ここで止められる(-20℃)。 | |
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| − | == | + | == [[トマトSNPマーカーのライブラリ化]]のLoop Adapterを結合にすすむ == |
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2020年10月21日 (水) 11:49時点における最新版
目次 |
[編集] PCR産物の断片化
- PCR産物約10 ng/50 µlをCovarisのチューブにいれる。
- 以下の条件でCovaris S2で断片化する
| DNAの長さ(目標) | 350bp |
| Duty Cycle | 10% |
| Intensity | 5 |
| Cycles per Burst | 200 |
| Time (duration) | 45 |
| Mode | Frequency sweeping |
[編集] 末端の修復 End Repair
[編集] NEBNext End Repair Module を使用
- 以下のように試薬を混ぜる
| PCR 産物 | 44 µl |
| NEBNext End Repair Reaction Buffer | 5 µl |
| NEBNext End Repair Enzyme Mix | 1 µl |
- 20℃で30分間保温する。
[編集] AMPureによる精製
- Sample Purification Beadsと水を以下のように混ぜる。
- DNAの長さ350bpのとき、Sample Purification Beads 60 µl、水 40 µl
- 希釈したSample Purification Beads 80 µlを加え、よく撹拌して、5分間室温で放置する。
- 遠心後、磁性スタンドに立て、上清を回収する。
- Sample Purification Beads 15 µlを加え、よく撹拌して、5分間室温で放置する。
- 遠心して上清を捨てる。
- 200 µl 80%エタノールを加え、30秒後、上清を捨てる。スタンドから外して混ぜたりする必要はない。2回行う。
- 遠心して上清を捨てたあと、5分間乾燥させる。
- 20 µl Resuspension Bufferを加え、懸濁する。2分室温で放置する。
- 上清 17.5 µl を回収する。ここで止められる(-20℃)。
