BigDye Terminaterを使ったシークエンス

2016年9月22日 (木) 21:33時点における版

BigDye Terminaterを使ったシークエンス　

用いる試薬

• BigDye　　　1µL

• BigDye用buffer 1µL

• プライマー 2µL

• RNA産物 適当量

• 脱イオン水 適当量

• 3M NaOAc 1µL

• 125mMEDTA 1µL

• 100%エタノール　25µL

• 70%エタノール　125µL

• HiDiホルムアシド　10µL

実験方法

1. 試薬5種(BigDye、BigDye用buffer、プライマー、RNA産物、脱イオン水)を8連チューブに入れて、混ぜる
2. PCR反応させる

   96℃　10秒

   50℃　5秒

   60℃　1分

   25サイクル

   12℃　∞

3. エッペン管にPCR産物、3M NaOAc、100%エタノールを加え、Maxrpmで20分遠心
4. 室温で20分放置
5. 70%エタノールを加え、Maxrpmで5分遠心
6. エタノールを抜いて、2分乾燥
7. HiDiホルムアシドを加え、heatshock 95℃、2分
8. 氷で冷やし、ボルテックスと遠心
9. シークエンス用の容器に全量入れる

シークエンス

• • バッファーと蒸留水の交換は10日で必要なので、予めシーケンサーの使用簿を確認すること**
  • 空気抜きを忘れないこと**