ゲノム編集した植物のシークエンスの解析

2021年11月6日 (土) 09:29時点における版

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CRISPR-Cas9でゲノム編集した植物のシークエンスを解析し、変異を同定する方法についての解説。

アグロバクテリウムの感染後、シークエンス解析に至るまでの流れ　（概要説明）
1) 形質転換されたT1植物を選抜し、生育する pKIベクターを用いた場合、T1種子の中から「OLE-tagRFPが光る」ものを播いて育てる　（＝T-DNAが組み込まれている）
2) 目的の遺伝子がゲノム編集されている個体を選抜・生育し、T2種子をとる genotyping：PCR＋制限酵素処理で、変異遺伝子を持つ個体を選抜　（制限酵素処理で、切れる：野生型（WT型）、切れない：変異型）
3) T2世代で、Cas9を持たない植物を選抜する pKIベクターを用いた場合、T2種子の中から「OLE-tagRFPが光らない」ものを播いて育てる　（＝T-DNA、Cas9を持たない）
4) T2世代で、目的の遺伝子がゲノム編集されている個体を選抜する 2) と同様のgenotypingを実施
5) キャピラリーシークエンサーでの解析 4) のgenotypingの時のPCR産物（制限酵素処理する前のもの）を、キャピラリーシークエンサーで解析する PCRに用いた両端のプライマー各々で解析したファイルを作成。このファイルを用いて以降の解析を行う

(1) 解析に使うファイルを準備する

• キャピラリーシークエンサーで読んだ波形ファイル（拡張子.ab1）

• ゲノム編集した箇所をはさんだ領域をPCRで増幅したものを、両側のプライマーでシークエンス解析したファイル

• ゲノム編集した「遺伝子のもとの配列」と「sgRNAの配列（PAM配列まで含めて）」。FASTA形式で保存する
  

• 「メモ帳」等のテキストエディタを起動し、以下の内容を記述したファイルを作成する（ファイル保存時に、拡張子を「.txt」から「.fasta」に変更）

(2) シーケンスアセンブリソフトウェア「ATGC」を起動

• 「ATGC」は共通PCにインストールしてあります

自分のPCで解析したい場合
インストール方法：中部大学総合情報センターから「Genetyx」をダウンロード・インストールして使用する http://www.isc.chubu.ac.jp/services/chubu/genetyx.html 上記ページへのアクセス、および「Genetyx」のダウンロード・インストールは中部大学内のネットワークへの接続が必要
起動方法：「ATGC」は遺伝情報処理ソフトウェア「Genetyx」内にあるので、以下のいずれかの方法で起動する (A) 各自のPCの「C:ドライブ」-「Program Files」-「Genetyx_VerXX_Net」フォルダ内の「ATGC.exe」を起動 (B) 「Genetyx」を起動し、ツールバーの「起動」-「ATGC」を選択 (B)の方法で起動する場合は、ネットワーク認証が必要で、PCが中部大学内のネットワークに接続されている必要がある　（なので、(A)を推奨）
初期設定：「ATGC」は初回使用時にパラメータを設定する必要がある（共通PCは設定済み） 「ファイル」-「環境設定」-「解析」を選択し 最小ホモロジースコア「30」 最小一致塩基数「10」 に変更する

(3) 配列データをアセンブルして解析

1) 配列、およびシークエンス解析したファイルを取り込む（インポート）

「ファイル」-「新規」を選択し、(1)で用意したファイルを取り込む

2) 取り込んだ配列をアセンブルする

「解析」-「アセンブル」を選択し、さらに「アセンブル」を選択

• 「Contig」を展開（アセンブルした配列の表示）。
• sgRNAを選択すると、その配列の先頭＝ゲノム編集箇所に移動。
• 波形ウィンドウを表示させる。
  • 単一の波形が出現＝ホモ：そのまま配列を成形（→Aへ進む）
  • 重なった波形が出現＝Bi-allelic（2個のアリル（変異）が混ざっている）：波形を分離して解析（→Bへ進む）