ゲノム編集した植物のシークエンスの解析

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'''（注意：編集中！）'''　
 
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* CRISPR-Cas9でゲノム編集した植物のシークエンスを解析し、変異アリルを同定する方法についての解説
 
* CRISPR-Cas9でゲノム編集した植物のシークエンスを解析し、変異アリルを同定する方法についての解説
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'''これ以降は編集途中の産物'''
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(3) シークエンスデータを解読して配列を決定し、アリルを同定する
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==[1]（概要）ゲノム編集で変異体を作成する手順：pKIベクターを用いた場合==
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* 以下の説明は、pKIベクターの解説サイトの図に一部加筆したもの　　https://www.jst.go.jp/pr/announce/20161117-2/index.html
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:::（※ ガイドRNAの設計方法については、別記参照)
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==[2] ゲノム編集によってできる変異型のアリルについて==
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* CRISPR-Cas9によるゲノム編集では、PAM配列（NGG）の3塩基手前が切断される
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* その切断個所を修復する際に、「挿入・欠失 (indel)」が生じて、フレームシフト等の変異型アリルができる
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::* 以下は、ゲノム編集での変異アリルの例
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:::[[File:ゲノム編集での変異アリルの例.png|700px]]
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::* 挿入・欠失 (indel) は上記の例のように、数bpの場合もあれば、数十bp～100bp以上の場合もある
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==[3] 変異型アリルの検出（遺伝子型の同定：genotyping）==
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* ゲノム変種による変異の有無を検出できるように、制限酵素サイトの近傍にsgRNAを設計する　（変異が生じると制限酵素サイトが無くなる）
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:* sgRNAの配列と検出に用いた制限酵素の例、については上記[2]の図を参照
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:* この例では、383bpのPCR産物をHaeIII処理すると、以下の長さの断片になる
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::・（野生型）制限酵素(HaeIII)で切れる　　->　272bp, 111bp の2本の断片
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::・（変異型）制限酵素(HaeIII)で切れない　->　約383bp の断片
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:* 遺伝子型の同定を行う際の「DNA抽出、PCR、制限酵素処理」の手順については、「[[シロイヌナズナの遺伝子型の判定]]」を参照
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</td>
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[[File:PKIベクターでのゲノム編集概要.png|200px]]
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</td>
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</table>
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==[4] 変異型アリルの同定（ゲノム編集した植物のシークエンス解析）==
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'''(1) キャピラリーシークエンスを行う'''
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:* [3]で用いたPCR産物（制限酵素処理"前"のもの）を用いて、シークエンス解析を行う
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:* キャピラリーシークエンスの方法は、「[[BigDye Terminaterを使ったシークエンス]]」を参照
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:::* シークエンス反応時に使うプライマーは、[3]のPCRで使用した両側のプライマー
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:::::＝PCR産物１個につき、シークエンスは２サンプル、となる　（両側のプライマー＝センス、アンチセンスの２種類で読むため
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:::* 1反応 (計10ul) あたりに、PCR産物を "1ul" 使用する　
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::::（プライマーダイマーがある場合は、精製・定量したうえで、プロトコール通りの量を使用　（精製方法：[[NucleoSpin Gel and PCR Clean-upを使ったDNA精製]]）
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'''(2) 解析に使うデータ（ファイル）を準備する'''
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:* キャピラリーシークエンサーで読んだ波形ファイル（拡張子.ab1）　※上記(1)で得られたデータ
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:* ゲノム編集した「遺伝子のもとの配列」の情報（sgRNA配列の位置がわかるもの）
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'''(3) シークエンスデータを解読して配列を決定し、アリルを同定する'''
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:* シークエンスデータの解読方法については、「[[]]」を参照
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[[ゲノム編集した植物のシークエンスの解析：シーケンスアセンブリソフトウェア「ATGC」を使う場合]]
 
[[ゲノム編集した植物のシークエンスの解析：シーケンスアセンブリソフトウェア「ATGC」を使う場合]]

2021年11月11日 (木) 16:49時点における版

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（注意：編集中！）　

  • CRISPR-Cas9でゲノム編集した植物のシークエンスを解析し、変異アリルを同定する方法についての解説

[1] キャピラリーシーケンスを行い、 解析に使うデータ（ファイル）を準備する

※ 詳細は、「 シロイヌナズナのゲノム編集について：概要、変異アリルの検出・同定」の [4] 変異型アリルの同定（ゲノム編集した植物のシークエンス解析）を参照
  • キャピラリーシークエンサーで読んだ波形ファイル（拡張子.ab1）
  • ゲノム編集した箇所をはさんだ領域をPCRで増幅したものを、両側のプライマー（センス、アンチセンス）でシークエンス解析したファイル
  • ゲノム編集した「遺伝子のもとの配列」の情報
  • sgRNA配列の情報

[2] 「仮想実験室：Mitsucal」を用いてデータを解析する

  • 「仮想実験室：Mitsucal」のツール「波形分離（重なった波形を分離する）」を用いて解析を行う。
  1. 「仮想実験室：Mitsucal」のサイトへ移動　https://mitsucal.tsbio.info/vl/
  2. "やること"のプルダウンから「重なった波形を分離する」を選択
  3. "参照配列" に"遺伝子のもとの配列"をコピー＆ペーストし、波形ファイル（拡張子.ab1）を送信して、「Start」


これ以降は編集途中の産物

アグロバクテリウムの感染後、シークエンス解析に至るまでの流れ　（概要説明）
1) 形質転換されたT1植物を選抜し、生育する
  • pKIベクターを用いた場合、T1種子の中から「OLE-tagRFPが光る」ものを播いて育てる　（＝T-DNAが組み込まれている）
2) 目的の遺伝子がゲノム編集されている個体を選抜・生育し、T2種子をとる
  • genotyping：PCR＋制限酵素処理で、変異遺伝子を持つ個体を選抜　（制限酵素処理で、切れる：野生型（WT型）、切れない：変異型）
3) T2世代で、Cas9を持たない植物を選抜する
  • pKIベクターを用いた場合、T2種子の中から「OLE-tagRFPが光らない」ものを播いて育てる　（＝T-DNA、Cas9を持たない）
4) T2世代で、目的の遺伝子がゲノム編集されている個体を選抜する
  • 2) と同様のgenotypingを実施
5) キャピラリーシークエンサーでの解析
  • 4) のgenotypingの時のPCR産物（制限酵素処理する前のもの）を、キャピラリーシークエンサーで解析する
  • PCRに用いた両端のプライマー各々で解析したファイルを作成。このファイルを用いて以降の解析を行う


ゲノム編集した植物のシークエンスの解析：シーケンスアセンブリソフトウェア「ATGC」を使う場合

「https://www.tsbio.info/labowiki/index.php?title=%E3%82%B2%E3%83%8E%E3%83%A0%E7%B7%A8%E9%9B%86%E3%81%97%E3%81%9F%E6%A4%8D%E7%89%A9%E3%81%AE%E3%82%B7%E3%83%BC%E3%82%AF%E3%82%A8%E3%83%B3%E3%82%B9%E3%81%AE%E8%A7%A3%E6%9E%90&oldid=680」から取得
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