ゲノム編集した植物のシークエンスの解析

提供: 鈴木研Wiki
(版間での差分)
移動: 案内, 検索
 
(3人の利用者による、間の38版が非表示)
1行: 1行:
−
'''（注意：編集中！）'''
+
__NOTOC__
 +
'''（注意：編集中！）'''　
 +
* CRISPR-Cas9でゲノム編集した植物のシークエンスを解析し、変異アリルを同定する方法についての解説
 +
::* ゲノム編集の概要・変異アリルの検出方法(genotyping)については、「 [[シロイヌナズナのゲノム編集について：概要、変異アリルの検出・同定]]」を参照
  
−
CRISPR-Cas9でゲノム編集した植物のシークエンスを解析し、変異を同定する方法についての解説。
+
====[1] キャピラリーシーケンスを行い、 解析に使うデータ（ファイル）を準備する====
 +
:::※ 詳細は、「 [[シロイヌナズナのゲノム編集について：概要、変異アリルの検出・同定]]」の '''[4] 変異型アリルの同定（ゲノム編集した植物のシークエンス解析）'''を参照
 +
* キャピラリーシークエンサーで読んだ波形ファイル（拡張子.ab1）
 +
::* ゲノム編集した箇所をはさんだ領域をPCRで増幅したものを、両側のプライマー（センス、アンチセンス）でシークエンス解析したファイル
 +
* ゲノム編集した「遺伝子のもとの配列」の情報
 +
* sgRNA配列の情報
 +
<P>
  
−
:{| class="wikitable mw-collapsible mw-collapsed" data-expandtext="開く" data-collapsetext="閉じる"
+
====[2] 「仮想実験室：Mitsucal」を用いてデータを解析する====
−
!アグロバクテリウムの感染後、シークエンス解析に至るまでの流れ　（概要説明）
+
* 「仮想実験室：Mitsucal」のツール「波形分離（重なった波形を分離する）」を用いて解析を行う。
−
|-
+
::# 「仮想実験室：Mitsucal」のサイトへ移動　https://mitsucal.tsbio.info/vl/  <BR>
−
|1) 形質転換されたT1植物を選抜し、生育する
+
::# "やること"のプルダウンから「重なった波形を分離する」を選択 <BR>
−
:* pKIベクターを用いた場合、OLE-tagRFPが光る種子を播いて育てる
+
::# "参照配列" に"遺伝子のもとの配列"をコピー＆ペーストし、波形ファイル（拡張子.ab1）を送信して、「Start」
−
|-
+
−
|2) 目的の遺伝子がゲノム編集されている個体を選抜・生育し、T2種子をとる<BR>
+
−
:* genotyping：PCR＋制限酵素処理で、切れないバンドを持つ個体を選抜
+
−
|-
+
−
|3) T2世代で、Cas9を持たない植物を選抜する
+
−
:* pKIベクターを用いた場合、OLE-tagRFPが「光らない」種子を播いて育てる
+
−
|-
+
−
|4) T2世代で、目的の遺伝子がゲノム編集されている個体を選抜する
+
−
:* 2) と同様のgenotypingを実施
+
−
|-
+
−
|5) キャピラリーシークエンサーでの解析
+
−
:* 4) のgenotypingの時のPCR産物（制限酵素で切る前のもの）を、キャピラリーシークエンサーで解析する
+
−
::* PCRに用いた両端のプライマー各々で解析したファイルを作成。このファイルを用いて以降の解析を行う
+
−
|-
+
−
|}
+
−
 
+
−
'''(1) 解析に使うファイルを準備する'''
+
−
* キャピラリーシークエンサーで読んだ波形ファイル（拡張子.ab1）
+
−
::* ゲノム編集した箇所をはさんだ領域をPCRで増幅したものを、両側のプライマーでシークエンス解析したファイル
+
−
* ゲノム編集した「遺伝子のもとの配列」と「sgRNAの配列（PAM配列まで含めて）」。FASTA形式で保存する<BR>
+
−
::* 「メモ帳」等のテキストエディタを起動し、以下の内容を記述したファイルを作成する（ファイル保存時に、'''拡張子を「.txt」から「.fasta」に変更'''）
+
  
−
{|
+
* 「波形分離」ツールの使い方の解説は、鈴木研究室のホームページの記事を参照　http://biochemistry.isc.chubu.ac.jp/labo/suzuki/archives/812
−
|
+
:* [A] 波形が途中から二重に重なっている場合：Bi-allelic（2個のアリルを検出）
−
{| class="wikitable"
+
:* [B] 波形が最後まで1種類の場合：ホモ（アリルは1個）
−
|-
+
−
|>U540k<BR>
+
−
ATGGAAATCATGTCAAGAGAGAA.....<BR>
+
−
>sgRNA3+PAM<BR>
+
−
TGACAGAACCGGTATGGCCT'''GGG'''<BR>
+
−
|-
+
−
|}
+
−
| <div>
+
−
{|
+
−
|-
+
−
|（1行目）“>遺伝子名” を記入<BR>
+
−
（2行目）標的遺伝子のゲノムDNAの配列 を記入<BR>
+
−
（3行目）“>sgRNA名など” を記入<BR>
+
−
（4行目）sgRNAの配列（'''PAM'''含めて）を記入<BR>
+
−
|-
+
−
|}
+
−
</div>
+
−
|}
+
  
−
'''(2) シーケンスアセンブリソフトウェア「ATGC」を起動'''
 
−
*「ATGC」は共通PCにインストールしてあります
 
  
−
:::{| class="wikitable mw-collapsible mw-collapsed" data-expandtext="開く" data-collapsetext="閉じる"
+
'''これ以降は編集途中の産物'''
−
!自分のPCで解析したい場合
+
−
|-
+
−
|'''インストール方法'''：中部大学総合情報センターから「Genetyx」をダウンロード・インストールして使用する<BR>
+
−
http://www.isc.chubu.ac.jp/services/chubu/genetyx.html
+
−
* 上記ページへのアクセス、および「Genetyx」のダウンロード・インストールは中部大学内のネットワークへの接続が必要
+
−
|-
+
−
|'''起動方法'''：「ATGC」は遺伝情報処理ソフトウェア「Genetyx」内にあるので、以下のいずれかの方法で起動する
+
−
* (A) 各自のPCの「C:ドライブ」-「Program Files」-「Genetyx_VerXX_Net」フォルダ内の「ATGC.exe」を起動
+
−
* (B) 「Genetyx」を起動し、ツールバーの「起動」-「ATGC」を選択
+
−
** (B)の方法で起動する場合は、ネットワーク認証が必要で、PCが中部大学内のネットワークに接続されている必要がある　（なので、(A)を推奨）
+
−
|-
+
−
|'''初期設定'''：「ATGC」は初回使用時にパラメータを設定する必要がある（共通PCは設定済み）
+
−
*「ファイル」-「環境設定」-「解析」を選択し
+
−
**最小ホモロジースコア「30」
+
−
**最小一致塩基数「10」<BR>
+
−
に変更する
+
−
|}
+
  
−
'''(3) 配列データをアセンブルして解析'''
 
  
−
1) 配列、およびシークエンス解析したファイルを取り込む（インポート）
 
−
:「ファイル」-「新規」を選択し、(1)で用意したファイルを取り込む
 
−
2) 取り込んだ配列をアセンブルする
 
−
:「解析」-「アセンブル」を選択し、さらに「アセンブル」を選択
 
  
−
*「Contig」を展開（アセンブルした配列の表示）。
+
[[ゲノム編集した植物のシークエンスの解析：シーケンスアセンブリソフトウェア「ATGC」を使う場合]]
−
* sgRNAを選択すると、その配列の先頭＝ゲノム編集箇所に移動。
+
−
* 波形ウィンドウを表示させる。
+
−
** 単一の波形が出現＝ホモ：そのまま配列を成形（→Aへ進む）
+
−
** 重なった波形が出現＝Bi-allelic（2個のアリル（変異）が混ざっている）：波形を分離して解析（→Bへ進む）
+
−
*
+
−
*
+
−
*
+
−
*
+
−
*
+

2022年1月13日 (木) 14:14時点における最新版

（注意：編集中！）　

  • CRISPR-Cas9でゲノム編集した植物のシークエンスを解析し、変異アリルを同定する方法についての解説

[編集] [1] キャピラリーシーケンスを行い、 解析に使うデータ（ファイル）を準備する

※ 詳細は、「 シロイヌナズナのゲノム編集について：概要、変異アリルの検出・同定」の [4] 変異型アリルの同定（ゲノム編集した植物のシークエンス解析）を参照
  • キャピラリーシークエンサーで読んだ波形ファイル（拡張子.ab1）
  • ゲノム編集した箇所をはさんだ領域をPCRで増幅したものを、両側のプライマー（センス、アンチセンス）でシークエンス解析したファイル
  • ゲノム編集した「遺伝子のもとの配列」の情報
  • sgRNA配列の情報

[編集] [2] 「仮想実験室：Mitsucal」を用いてデータを解析する

  • 「仮想実験室：Mitsucal」のツール「波形分離（重なった波形を分離する）」を用いて解析を行う。
  1. 「仮想実験室：Mitsucal」のサイトへ移動　https://mitsucal.tsbio.info/vl/
  2. "やること"のプルダウンから「重なった波形を分離する」を選択
  3. "参照配列" に"遺伝子のもとの配列"をコピー＆ペーストし、波形ファイル（拡張子.ab1）を送信して、「Start」
  • [A] 波形が途中から二重に重なっている場合：Bi-allelic（2個のアリルを検出）
  • [B] 波形が最後まで1種類の場合：ホモ（アリルは1個）


これ以降は編集途中の産物


ゲノム編集した植物のシークエンスの解析：シーケンスアセンブリソフトウェア「ATGC」を使う場合

「https://www.tsbio.info/labowiki/index.php?title=%E3%82%B2%E3%83%8E%E3%83%A0%E7%B7%A8%E9%9B%86%E3%81%97%E3%81%9F%E6%A4%8D%E7%89%A9%E3%81%AE%E3%82%B7%E3%83%BC%E3%82%AF%E3%82%A8%E3%83%B3%E3%82%B9%E3%81%AE%E8%A7%A3%E6%9E%90&oldid=721」から取得
個人用ツール
名前空間

変種
操作
案内
ツール