ゲノム編集した植物のシークエンスの解析

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'''（注意：編集中！）'''
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'''（注意：編集中！）'''　
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* CRISPR-Cas9でゲノム編集した植物のシークエンスを解析し、変異アリルを同定する方法についての解説
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::* ゲノム編集の概要・変異アリルの検出方法(genotyping)については、「 [[シロイヌナズナのゲノム編集について：概要、変異アリルの検出・同定]]」を参照
  
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CRISPR-Cas9でゲノム編集した植物のシークエンスを解析し、変異を同定する方法についての解説。
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====[1] キャピラリーシーケンスを行い、 解析に使うデータ（ファイル）を準備する====
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:::※ 詳細は、「 [[シロイヌナズナのゲノム編集について：概要、変異アリルの検出・同定]]」の '''[4] 変異型アリルの同定（ゲノム編集した植物のシークエンス解析）'''を参照
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* キャピラリーシークエンサーで読んだ波形ファイル（拡張子.ab1）
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::* ゲノム編集した箇所をはさんだ領域をPCRで増幅したものを、両側のプライマー（センス、アンチセンス）でシークエンス解析したファイル
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* ゲノム編集した「遺伝子のもとの配列」の情報
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* sgRNA配列の情報
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<P>
  
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:{| class="wikitable mw-collapsible mw-collapsed" data-expandtext="開く" data-collapsetext="閉じる"
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====[2] 「仮想実験室：Mitsucal」を用いてデータを解析する====
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!アグロバクテリウムの感染後、シークエンス解析に至るまでの流れ　（概要説明）
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* 「仮想実験室：Mitsucal」のツール「波形分離（重なった波形を分離する）」を用いて解析を行う。
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::# 「仮想実験室：Mitsucal」のサイトへ移動　https://mitsucal.tsbio.info/vl/  <BR>
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|1) 形質転換されたT1植物を選抜し、生育する
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::# "やること"のプルダウンから「重なった波形を分離する」を選択 <BR>
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:* pKIベクターを用いた場合、T1種子の中からOLE-tagRFPが光るものを播いて育てる
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::# "参照配列" に"遺伝子のもとの配列"をコピー＆ペーストし、波形ファイル（拡張子.ab1）を送信して、「Start」
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|2) 目的の遺伝子がゲノム編集されている個体を選抜・生育し、T2種子をとる<BR>
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:* genotyping：PCR＋制限酵素処理で、変異遺伝子を持つ個体を選抜　（制限酵素処理で、切れる：野生型（WT型）、切れない：変異型）
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|3) T2世代で、Cas9を持たない植物を選抜する
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:* pKIベクターを用いた場合、T2種子の中からOLE-tagRFPが「光らない」ものを播いて育てる
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|4) T2世代で、目的の遺伝子がゲノム編集されている個体を選抜する
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:* 2) と同様のgenotypingを実施
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|5) キャピラリーシークエンサーでの解析
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:* 4) のgenotypingの時のPCR産物（制限酵素で切る前のもの）を、キャピラリーシークエンサーで解析する
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::* PCRに用いた両端のプライマー各々で解析したファイルを作成。このファイルを用いて以降の解析を行う
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'''(1) 解析に使うファイルを準備する'''
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* キャピラリーシークエンサーで読んだ波形ファイル（拡張子.ab1）
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::* ゲノム編集した箇所をはさんだ領域をPCRで増幅したものを、両側のプライマーでシークエンス解析したファイル
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* ゲノム編集した「遺伝子のもとの配列」と「sgRNAの配列（PAM配列まで含めて）」。FASTA形式で保存する<BR>
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::* 「メモ帳」等のテキストエディタを起動し、以下の内容を記述したファイルを作成する（ファイル保存時に、'''拡張子を「.txt」から「.fasta」に変更'''）
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* 「波形分離」ツールの使い方の解説は、鈴木研究室のホームページの記事を参照　http://biochemistry.isc.chubu.ac.jp/labo/suzuki/archives/812
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:* [A] 波形が途中から二重に重なっている場合：Bi-allelic（2個のアリルを検出）
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{| class="wikitable"
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:* [B] 波形が最後まで1種類の場合：ホモ（アリルは1個）
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|>U540k<BR>
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ATGGAAATCATGTCAAGAGAGAA.....<BR>
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>sgRNA3+PAM<BR>
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TGACAGAACCGGTATGGCCT'''GGG'''<BR>
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| <div>
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|（1行目）“>遺伝子名” を記入<BR>
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（2行目）標的遺伝子のゲノムDNAの配列 を記入<BR>
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（3行目）“>sgRNA名など” を記入<BR>
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（4行目）sgRNAの配列（'''PAM'''含めて）を記入<BR>
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</div>
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'''(2) シーケンスアセンブリソフトウェア「ATGC」を起動'''
 
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*「ATGC」は共通PCにインストールしてあります
 
  
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:::{| class="wikitable mw-collapsible mw-collapsed" data-expandtext="開く" data-collapsetext="閉じる"
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'''これ以降は編集途中の産物'''
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!自分のPCで解析したい場合
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|'''インストール方法'''：中部大学総合情報センターから「Genetyx」をダウンロード・インストールして使用する<BR>
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http://www.isc.chubu.ac.jp/services/chubu/genetyx.html
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* 上記ページへのアクセス、および「Genetyx」のダウンロード・インストールは中部大学内のネットワークへの接続が必要
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|'''起動方法'''：「ATGC」は遺伝情報処理ソフトウェア「Genetyx」内にあるので、以下のいずれかの方法で起動する
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* (A) 各自のPCの「C:ドライブ」-「Program Files」-「Genetyx_VerXX_Net」フォルダ内の「ATGC.exe」を起動
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* (B) 「Genetyx」を起動し、ツールバーの「起動」-「ATGC」を選択
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** (B)の方法で起動する場合は、ネットワーク認証が必要で、PCが中部大学内のネットワークに接続されている必要がある　（なので、(A)を推奨）
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|'''初期設定'''：「ATGC」は初回使用時にパラメータを設定する必要がある（共通PCは設定済み）
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*「ファイル」-「環境設定」-「解析」を選択し
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**最小ホモロジースコア「30」
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**最小一致塩基数「10」<BR>
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に変更する
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|}
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'''(3) 配列データをアセンブルして解析'''
 
  
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1) 配列、およびシークエンス解析したファイルを取り込む（インポート）
 
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:「ファイル」-「新規」を選択し、(1)で用意したファイルを取り込む
 
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2) 取り込んだ配列をアセンブルする
 
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:「解析」-「アセンブル」を選択し、さらに「アセンブル」を選択
 
  
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*「Contig」を展開（アセンブルした配列の表示）。
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[[ゲノム編集した植物のシークエンスの解析：シーケンスアセンブリソフトウェア「ATGC」を使う場合]]
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* sgRNAを選択すると、その配列の先頭＝ゲノム編集箇所に移動。
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* 波形ウィンドウを表示させる。
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** 単一の波形が出現＝ホモ：そのまま配列を成形（→Aへ進む）
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** 重なった波形が出現＝Bi-allelic（2個のアリル（変異）が混ざっている）：波形を分離して解析（→Bへ進む）
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2022年1月13日 (木) 14:14時点における最新版

（注意：編集中！）　

  • CRISPR-Cas9でゲノム編集した植物のシークエンスを解析し、変異アリルを同定する方法についての解説

[編集] [1] キャピラリーシーケンスを行い、 解析に使うデータ（ファイル）を準備する

※ 詳細は、「 シロイヌナズナのゲノム編集について：概要、変異アリルの検出・同定」の [4] 変異型アリルの同定（ゲノム編集した植物のシークエンス解析）を参照
  • キャピラリーシークエンサーで読んだ波形ファイル（拡張子.ab1）
  • ゲノム編集した箇所をはさんだ領域をPCRで増幅したものを、両側のプライマー（センス、アンチセンス）でシークエンス解析したファイル
  • ゲノム編集した「遺伝子のもとの配列」の情報
  • sgRNA配列の情報

[編集] [2] 「仮想実験室：Mitsucal」を用いてデータを解析する

  • 「仮想実験室：Mitsucal」のツール「波形分離（重なった波形を分離する）」を用いて解析を行う。
  1. 「仮想実験室：Mitsucal」のサイトへ移動　https://mitsucal.tsbio.info/vl/
  2. "やること"のプルダウンから「重なった波形を分離する」を選択
  3. "参照配列" に"遺伝子のもとの配列"をコピー＆ペーストし、波形ファイル（拡張子.ab1）を送信して、「Start」
  • [A] 波形が途中から二重に重なっている場合：Bi-allelic（2個のアリルを検出）
  • [B] 波形が最後まで1種類の場合：ホモ（アリルは1個）


これ以降は編集途中の産物


ゲノム編集した植物のシークエンスの解析：シーケンスアセンブリソフトウェア「ATGC」を使う場合

「https://www.tsbio.info/labowiki/index.php?title=%E3%82%B2%E3%83%8E%E3%83%A0%E7%B7%A8%E9%9B%86%E3%81%97%E3%81%9F%E6%A4%8D%E7%89%A9%E3%81%AE%E3%82%B7%E3%83%BC%E3%82%AF%E3%82%A8%E3%83%B3%E3%82%B9%E3%81%AE%E8%A7%A3%E6%9E%90&oldid=721」から取得
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