ゲノム編集した植物のシークエンスの解析

2022年1月13日 (木) 14:14時点における最新版

（注意：編集中！）　

CRISPR-Cas9でゲノム編集した植物のシークエンスを解析し、変異アリルを同定する方法についての解説

ゲノム編集の概要・変異アリルの検出方法(genotyping)については、「シロイヌナズナのゲノム編集について：概要、変異アリルの検出・同定」を参照

[編集] [1] キャピラリーシーケンスを行い、解析に使うデータ（ファイル）を準備する

※ 詳細は、「シロイヌナズナのゲノム編集について：概要、変異アリルの検出・同定」の [4] 変異型アリルの同定（ゲノム編集した植物のシークエンス解析）を参照

キャピラリーシークエンサーで読んだ波形ファイル（拡張子.ab1）

ゲノム編集した箇所をはさんだ領域をPCRで増幅したものを、両側のプライマー（センス、アンチセンス）でシークエンス解析したファイル

ゲノム編集した「遺伝子のもとの配列」の情報
sgRNA配列の情報

[編集] [2] 「仮想実験室：Mitsucal」を用いてデータを解析する

「仮想実験室：Mitsucal」のツール「波形分離（重なった波形を分離する）」を用いて解析を行う。

「仮想実験室：Mitsucal」のサイトへ移動　https://mitsucal.tsbio.info/vl/
"やること"のプルダウンから「重なった波形を分離する」を選択
"参照配列" に"遺伝子のもとの配列"をコピー＆ペーストし、波形ファイル（拡張子.ab1）を送信して、「Start」

「波形分離」ツールの使い方の解説は、鈴木研究室のホームページの記事を参照　http://biochemistry.isc.chubu.ac.jp/labo/suzuki/archives/812

[A] 波形が途中から二重に重なっている場合：Bi-allelic（2個のアリルを検出）
[B] 波形が最後まで1種類の場合：ホモ（アリルは1個）

これ以降は編集途中の産物

ゲノム編集した植物のシークエンスの解析：シーケンスアセンブリソフトウェア「ATGC」を使う場合

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+__NOTOC__
 '''（注意：編集中！）'''
 * CRISPR-Cas9でゲノム編集した植物のシークエンスを解析し、変異アリルを同定する方法についての解説
 ::* ゲノム編集の概要・変異アリルの検出方法(genotyping)については、「 [[シロイヌナズナのゲノム編集について：概要、変異アリルの検出・同定]]」を参照
-====[1]キャピラリーシーケンスを行い、 解析に使うデータ（ファイル）を準備する====
+====[1] キャピラリーシーケンスを行い、 解析に使うデータ（ファイル）を準備する====
 :::※ 詳細は、「 [[シロイヌナズナのゲノム編集について：概要、変異アリルの検出・同定]]」の '''[4] 変異型アリルの同定（ゲノム編集した植物のシークエンス解析）'''を参照
 * キャピラリーシークエンサーで読んだ波形ファイル（拡張子.ab1）
 ::* ゲノム編集した箇所をはさんだ領域をPCRで増幅したものを、両側のプライマー（センス、アンチセンス）でシークエンス解析したファイル
-* ゲノム編集した「遺伝子のもとの配列」の情報（sgRNA配列の位置がわかるもの）
+* ゲノム編集した「遺伝子のもとの配列」の情報
+* sgRNA配列の情報
+<P>
+====[2] 「仮想実験室：Mitsucal」を用いてデータを解析する====
+* 「仮想実験室：Mitsucal」のツール「波形分離（重なった波形を分離する）」を用いて解析を行う。
+::# 「仮想実験室：Mitsucal」のサイトへ移動　https://mitsucal.tsbio.info/vl/  <BR>
+::# "やること"のプルダウンから「重なった波形を分離する」を選択 <BR>
+::# "参照配列" に"遺伝子のもとの配列"をコピー＆ペーストし、波形ファイル（拡張子.ab1）を送信して、「Start」
+* 「波形分離」ツールの使い方の解説は、鈴木研究室のホームページの記事を参照　http://biochemistry.isc.chubu.ac.jp/labo/suzuki/archives/812
+:* [A] 波形が途中から二重に重なっている場合：Bi-allelic（2個のアリルを検出）
+:* [B] 波形が最後まで1種類の場合：ホモ（アリルは1個）
-==[1]（概要）ゲノム編集で変異体を作成する手順：pKIベクターを用いた場合==
-* 以下の説明は、pKIベクターの解説サイトの図に一部加筆したもの　　https://www.jst.go.jp/pr/announce/20161117-2/index.html
-:::（※ ガイドRNAの設計方法については、別記参照)
-[[File:PKIベクターでのゲノム編集概要.png|700px]]
+'''これ以降は編集途中の産物'''
-:{| class="wikitable mw-collapsible mw-collapsed" data-expandtext="開く" data-collapsetext="閉じる"
-!アグロバクテリウムの感染後、シークエンス解析に至るまでの流れ　（概要説明）
-|-
-|1) 形質転換されたT1植物を選抜し、生育する
-:* pKIベクターを用いた場合、T1種子の中から「OLE-tagRFPが光る」ものを播いて育てる　（＝T-DNAが組み込まれている）
-|-
-|2) 目的の遺伝子がゲノム編集されている個体を選抜・生育し、T2種子をとる<BR>
-:* genotyping：PCR＋制限酵素処理で、変異遺伝子を持つ個体を選抜　（制限酵素処理で、切れる：野生型（WT型）、切れない：変異型）
-|-
-|3) T2世代で、Cas9を持たない植物を選抜する
-:* pKIベクターを用いた場合、T2種子の中から「OLE-tagRFPが光らない」ものを播いて育てる　（＝T-DNA、Cas9を持たない）
-|-
-|4) T2世代で、目的の遺伝子がゲノム編集されている個体を選抜する
-:* 2) と同様のgenotypingを実施
-|-
-|5) キャピラリーシークエンサーでの解析
-:* 4) のgenotypingの時のPCR産物（制限酵素処理する前のもの）を、キャピラリーシークエンサーで解析する
-::* PCRに用いた両端のプライマー各々で解析したファイルを作成。このファイルを用いて以降の解析を行う
-|-
-|}
-==[2] ゲノム編集によってできる変異型のアリルについて==
-* CRISPR-Cas9によるゲノム編集では、PAM配列（NGG）の3塩基手前が切断される
-* その切断個所を修復する際に、「挿入・欠失 (indel)」が生じて、フレームシフト等の変異型アリルができる
-::* 以下は、ゲノム編集での変異アリルの例
-:::[[File:ゲノム編集での変異アリルの例.png|700px]]
-::* 挿入・欠失 (indel) は上記の例のように、数bpの場合もあれば、数十bp～100bp以上の場合もある
-==[3] 変異型アリルの検出（遺伝子型の同定：genotyping）==
-<table>
-   <tr>
-<td>
-* ゲノム変種による変異の有無を検出できるように、制限酵素サイトの近傍にsgRNAを設計する　（変異が生じると制限酵素サイトが無くなる）
-:* sgRNAの配列と検出に用いた制限酵素の例、については上記[2]の図を参照
-:* この例では、383bpのPCR産物をHaeIII処理すると、以下の長さの断片になる
-::・（野生型）制限酵素(HaeIII)で切れる　　->　272bp, 111bp の2本の断片
-::・（変異型）制限酵素(HaeIII)で切れない　->　約383bp の断片
-:* 遺伝子型の同定を行う際の「DNA抽出、PCR、制限酵素処理」の手順については、「[[シロイヌナズナの遺伝子型の判定]]」を参照
-</td>
-<td>
-[[File:PKIベクターでのゲノム編集概要.png|200px]]
-</td>
-</table>
-==[4] 変異型アリルの同定（ゲノム編集した植物のシークエンス解析）==
-'''(1) キャピラリーシークエンスを行う'''
-:* [3]で用いたPCR産物（制限酵素処理"前"のもの）を用いて、シークエンス解析を行う
-:* キャピラリーシークエンスの方法は、「[[BigDye Terminaterを使ったシークエンス]]」を参照
-:::* シークエンス反応時に使うプライマーは、[3]のPCRで使用した両側のプライマー
-:::::＝PCR産物１個につき、シークエンスは２サンプル、となる　（両側のプライマー＝センス、アンチセンスの２種類で読むため
-:::* 1反応 (計10ul) あたりに、PCR産物を "1ul" 使用する
-::::（プライマーダイマーがある場合は、精製・定量したうえで、プロトコール通りの量を使用　（精製方法：[[NucleoSpin Gel and PCR Clean-upを使ったDNA精製]]）
-'''(2) 解析に使うデータ（ファイル）を準備する'''
-:* キャピラリーシークエンサーで読んだ波形ファイル（拡張子.ab1）　※上記(1)で得られたデータ
-:* ゲノム編集した「遺伝子のもとの配列」の情報（sgRNA配列の位置がわかるもの）
-'''(3) シークエンスデータを解読して配列を決定し、アリルを同定する'''
-:* シークエンスデータの解読方法については、「[[]]」を参照
-*
-*
 [[ゲノム編集した植物のシークエンスの解析：シーケンスアセンブリソフトウェア「ATGC」を使う場合]]

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