遺伝子型判定時のマーカーの一覧
提供: 鈴木研Wiki
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== drol1-1変異体と各sudl変異体の遺伝子マーカー == | == drol1-1変異体と各sudl変異体の遺伝子マーカー == | ||
==== プライマーと制限酵素の組合せ ==== | ==== プライマーと制限酵素の組合せ ==== | ||
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! 変異体 !! 遺伝子名 !! PCRのプライマー !! プライマー配列 !! PCR断片長 !! 制限酵素 !! 制限酵素処理後の長さ | ! 変異体 !! 遺伝子名 !! PCRのプライマー !! プライマー配列 !! PCR断片長 !! 制限酵素 !! 制限酵素処理後の長さ | ||
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2023年8月4日 (金) 09:59時点における版
試薬
- 0.4M NaOH
- 0.1M Tris-HCl pH 6.8
DNA抽出 マルチビーズショッカー
- 葉を一枚切り取り、サンプル破砕用チューブに入れる
- ビーズを一粒入れる
- 40 µlの0.4M NaOHを入れる
- 2000rpmで5秒オン、2秒オフのサイクルを2回行う
- 遠心(フラッシュ)
- 200 µlの0.1M Tris-HClを加える
- よく混合し、遠心(フラッシュ)
- 上清を鋳型として用いる
PCR
反応液の組成
| 1サンプル | |
| ExTaq | 0.1 µl |
| 10×ExTaq Buffer | 2 µl |
| 2.5mM dNTP | 1.6 µl |
| プライマー | 終濃度0.2 µM |
| プライマー | 終濃度0.2 µM |
| DNA | 1 µl |
| 滅菌水 | up to 20 µl |
| 合計 | 20 µl |
反応
- 95℃ 3分
- [95℃ 45秒、(アニーリング)55℃ 45秒、(伸長反応)72℃ 2分] のサイクルを35回
- 72℃ 5分 (→ 4℃ ∞)
＜drol1変異体の判別方法＞
| 判定する 遺伝子型 |
プライマーの組み合せ | アニーリング温度 | 伸長時間 | PCR後の バンドの長さ |
備考 | |
|---|---|---|---|---|---|---|
| [A] | drol1-1 | ・At3g24730#143-F ・drol1-1_HindIII |
55℃ | 1 min でOK | (185 bp) | このPCR産物をさらに制限酵素 Hind III で切って判別 ※方法は下記参照 HindIII処理後、(WT)185 bp (drol1-1)152 + 33 bp |
| [B] | drol1-2 | ・At3g24730#143-F ・drol1-1_HindIII ・LBb1.3 |
55℃ | 2 min | 「WT」 185 bp 「T-DNA = drol1-2」 ≒355 bp |
プライマー3種類を混ぜて、「WT」「T-DNA = drol1-2」の判別を1回のPCRで判定 ※各々の増幅プライマーの組み合せ ・「WT」：At3g24730#143-F, drol1-1_HindIII ・「T-DNA = drol1-2」：At3g24730#143-F, LBb1.3 |
| [C] | drol1-1, drol1-2 ※同時に判別する場合 |
・At3g24730#143-F ・drol1-1_HindIII ・LBb1.3 |
55℃ | 2 min | 「WT」「drol1-1」 185 bp 「T-DNA = drol1-2」 ≒355 bp |
上記の[A][B]を組み合わせた検出方法 PCR後に制限酵素 Hind III で切って判別 HindIII処理後、(WT)185 bp (drol1-1)152 + 33 bp (drol1-2)≒355 bp |
| [D] | drol1-2 ※old ver. 上記推奨 |
「WT」 ・At3g24730#143-F ・anti6_At3724730 「T-DNA = drol1-2」 ・At3g24730#143-F ・LBb1.3 |
55℃ | 2 min | 「WT」 371 bp 「T-DNA = drol1-2」 ≒355 bp |
各個体について、「WT」「T-DNA = drol1-2」の2種類のPCRを行った結果を合わせて判断。 このプライマーでは、「WT」「T-DNA = drol1-2」のバンドの長さの差が小さいため、上記[B]のようなプライマー3種類を混ぜたPCRでは判別できない |
＜drol1-1変異体の判別（Hind III 処理）＞
| 1サンプル | |
| 滅菌水 | 5.7 µl |
| 10xM Buffer | 1 µl |
| Hind III | 0.3 µl |
| PCR産物（上記参照） | 3 µl |
| 合計 | 10 µl |
MultiNAで泳動し、バンドの長さを判別
※Hind III処理後、(WT)185 bp (drol1-1)152 + 33 bp
＜各drol1変異体の変異箇所とプライマーの結合部位＞
drol1-1変異体と各sudl変異体の遺伝子マーカー
プライマーと制限酵素の組合せ
| 変異体 | 遺伝子名 | PCRのプライマー | プライマー配列 | PCR断片長 | 制限酵素 | 制限酵素処理後の長さ |
|---|---|---|---|---|---|---|
| drol1-1 |
DROL1 | At3g24730#143-F drol1-1_dCAPS-HindIII |
TGATATCACGTTGTTTCCTTCG GAAATGCACCAACCCATTTAGTATGATCCGAAGCT |
185bp | HindIII | (WT) 185bp (drol1-1) 152+33bp |
| sudl1-1 #8-5 |
U5-40k | m2g181F m2g181R |
CAAGATACAATCACAGGTATGAGC CACAGCTTTGAAATTCAGATCTCTC |
383bp | HaeIII | (WT) 272+111bp (#8-5) 383bp |
| sudl2-1 #47-1a |
PRP6 | prp6_47-1aF prp6_47-1aR |
GCTGAGGAGAAAAGGTACGATGAGA CCTCTGATCAATAGACTCCCAGATGGCATCAAGCT |
135bp | HindIII | (WT) 135bp (#47-1a) 102+33bp |
| sudl3-1 #14-4 |
PRP8 | prp8_14-4F prp8_14-4R |
CAACCCGCAGAAAAGCTACTGCAGTCCTCTCGATC AGTGACTCTTTTGCATCTTGCTTG |
161bp | PvuI | (WT) 128+33bp (#14-4) 161bp |
| sudl3-2 #49-4a |
PRP8 | prp8_49-4aF prp8_49-4aR |
ATTCATACTTTATTAATTATAGACATTGAGCCACG ATTCTTGGCGGACACATAGTCTGCAATATTGAGCT |
130bp | SacI | (WT) 97+33bp (#49-4a) 130bp |
| sudl3-3 #51-2a |
PRP8 | prp8_51-2aF prp8_51-2aR |
ACCTGAAAGATGGTCCGTATGTCACTCCAGACTAA CTTTGTGTCATGTTTGTATGACAATGGAGGGAATG |
131bp | DdeI | (WT) 97+34bp (#51-2a) 131bp |
| sudl4-1 #40-2b |
SmBb | smbb_40-2bF smbb_40-2bR |
GCTTCAGTTCATCAACTACAGG CTTCTTCCCTTTAGCTGGTGGTAGCTTACGAAGCT |
148bp | HindIII | (WT) 148bp (#40-2b) 113+35bp |
| sudl4-2 #43-2b |
SmBb | smbb_43-2bF smbb_43-2bR |
TCGTGCTAAAGCTGGCTCTGCAGCTGCTGTTGCGG TCCACCAACACCACGAACAGGAC |
133bp | BamHI | (WT) 133bp (#43-2b) 97+36bp |
