遺伝子型判定時のマーカーの一覧

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| DROL1|| At3g24730#143-F <br> drol1-1_dCAPS-HindIII|| TGATATCACGTTGTTTCCTTCG <br> GAAATGCACCAACCCATTTAGTATGATCCGAAGCT|| 185bp|| HindIII|| (WT) 185bp <br> (drol1-1) 152+33bp
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| DROL1|| At3g24730#143-F <br> drol1-1_dCAPS-HindIII|| TGATATCACGTTGTTTCCTTCG <br> GAAATGCACCAACCCATTTAGTATGATCCGAAGCT|| 185 bp|| HindIII|| (WT) 185 bp <br> (drol1-1) 152+33 bp
 
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! sudl1-1 <br> #8-5
 
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| U5-40k|| m2g181F <br> m2g181R|| CAAGATACAATCACAGGTATGAGC <br> CACAGCTTTGAAATTCAGATCTCTC|| 383bp|| HaeIII|| (WT) 272+111bp <br> (#8-5) 383bp
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| U5-40k|| m2g181F <br> m2g181R|| CAAGATACAATCACAGGTATGAGC <br> CACAGCTTTGAAATTCAGATCTCTC|| 383 bp|| HaeIII|| (WT) 272+111 bp <br> (#8-5) 383 bp
 
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! sudl2-1 <br> #47-1a
 
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| PRP6|| prp6_47-1aF <br> prp6_47-1aR|| GCTGAGGAGAAAAGGTACGATGAGA <br> CCTCTGATCAATAGACTCCCAGATGGCATCAAGCT|| 135bp|| HindIII|| (WT) 135bp <br> (#47-1a) 102+33bp
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| PRP6|| prp6_47-1aF <br> prp6_47-1aR|| GCTGAGGAGAAAAGGTACGATGAGA <br> CCTCTGATCAATAGACTCCCAGATGGCATCAAGCT|| 135 bp|| HindIII|| (WT) 135 bp <br> (#47-1a) 102+33 bp
 
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! sudl3-1 <br> #14-4
 
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| PRP8|| prp8_14-4F <br> prp8_14-4R|| CAACCCGCAGAAAAGCTACTGCAGTCCTCTCGATC <br> AGTGACTCTTTTGCATCTTGCTTG|| 161bp|| PvuI|| (WT) 128+33bp <br> (#14-4) 161bp
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| PRP8|| prp8_14-4F <br> prp8_14-4R|| CAACCCGCAGAAAAGCTACTGCAGTCCTCTCGATC <br> AGTGACTCTTTTGCATCTTGCTTG|| 161 bp|| PvuI|| (WT) 128+33 bp <br> (#14-4) 161 bp
 
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! sudl3-2 <br> #49-4a
 
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| PRP8|| prp8_49-4aF <br> prp8_49-4aR|| ATTCATACTTTATTAATTATAGACATTGAGCCACG <br> ATTCTTGGCGGACACATAGTCTGCAATATTGAGCT|| 130bp|| SacI|| (WT) 97+33bp <br> (#49-4a) 130bp
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| PRP8|| prp8_49-4aF <br> prp8_49-4aR|| ATTCATACTTTATTAATTATAGACATTGAGCCACG <br> ATTCTTGGCGGACACATAGTCTGCAATATTGAGCT|| 130 bp|| SacI|| (WT) 97+33 bp <br> (#49-4a) 130 bp
 
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! sudl3-3 <br> #51-2a
 
! sudl3-3 <br> #51-2a
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| PRP8|| prp8_51-2aF <br> prp8_51-2aR|| ACCTGAAAGATGGTCCGTATGTCACTCCAGACTAA <br> CTTTGTGTCATGTTTGTATGACAATGGAGGGAATG|| 131bp|| DdeI|| (WT) 97+34bp <br> (#51-2a) 131bp
+
| PRP8|| prp8_51-2aF <br> prp8_51-2aR|| ACCTGAAAGATGGTCCGTATGTCACTCCAGACTAA <br> CTTTGTGTCATGTTTGTATGACAATGGAGGGAATG|| 131 bp|| DdeI|| (WT) 97+34 bp <br> (#51-2a) 131 bp
 
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! sudl4-1 <br> #40-2b
 
! sudl4-1 <br> #40-2b
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| SmBb|| smbb_40-2bF <br> smbb_40-2bR|| GCTTCAGTTCATCAACTACAGG <br> CTTCTTCCCTTTAGCTGGTGGTAGCTTACGAAGCT|| 148bp|| HindIII|| (WT) 148bp <br> (#40-2b) 113+35bp
+
| SmBb|| smbb_40-2bF <br> smbb_40-2bR|| GCTTCAGTTCATCAACTACAGG <br> CTTCTTCCCTTTAGCTGGTGGTAGCTTACGAAGCT|| 148 bp|| HindIII|| (WT) 148 bp <br> (#40-2b) 113+35 bp
 
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! sudl4-2 <br> #43-2b
 
! sudl4-2 <br> #43-2b
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| SmBb|| smbb_43-2bF <br> smbb_43-2bR|| TCGTGCTAAAGCTGGCTCTGCAGCTGCTGTTGCGG <br> TCCACCAACACCACGAACAGGAC|| 133bp|| BamHI|| (WT) 133bp <br> (#43-2b) 97+36bp
+
| SmBb|| smbb_43-2bF <br> smbb_43-2bR|| TCGTGCTAAAGCTGGCTCTGCAGCTGCTGTTGCGG <br> TCCACCAACACCACGAACAGGAC|| 133 bp|| BamHI|| (WT) 133 bp <br> (#43-2b) 97+36 bp
 
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2023年8月4日 (金) 10:16時点における版

試薬

  • 0.4M NaOH
  • 0.1M Tris-HCl pH 6.8

DNA抽出 　マルチビーズショッカー

  1. 葉を一枚切り取り、サンプル破砕用チューブに入れる
  2. ビーズを一粒入れる
  3. 40 µlの0.4M NaOHを入れる
  4. 2000rpmで5秒オン、2秒オフのサイクルを2回行う
  5. 遠心(フラッシュ)
  6. 200 µlの0.1M Tris-HClを加える
  7. よく混合し、遠心(フラッシュ)
  8. 上清を鋳型として用いる

PCR

反応液の組成

1サンプル
ExTaq 0.1 µl
10×ExTaq Buffer 2 µl
2.5mM dNTP 1.6 µl
プライマー 終濃度0.2 µM
プライマー 終濃度0.2 µM
DNA 1 µl
滅菌水 up to 20 µl
合計 20 µl

反応

  1. 95℃ 3分
  2. [95℃ 45秒、(アニーリング)55℃ 45秒、(伸長反応)72℃ 2分] のサイクルを35回
  3. 72℃ 5分 (→ 4℃ ∞)


＜drol1変異体の判別方法＞

判定する
遺伝子型 		プライマーの組み合せ アニーリング温度 伸長時間 PCR後の
バンドの長さ 		備考
[A] drol1-1 ・At3g24730#143-F
・drol1-1_HindIII 		55℃ 1 min でOK (185 bp) このPCR産物をさらに制限酵素 Hind III で切って判別 　※方法は下記参照
HindIII処理後、(WT)185 bp　 (drol1-1)152 + 33 bp
[B] drol1-2 ・At3g24730#143-F
・drol1-1_HindIII
・LBb1.3		 55℃ 2 min 「WT」
185 bp

「T-DNA = drol1-2」
≒355 bp 		プライマー3種類を混ぜて、「WT」「T-DNA = drol1-2」の判別を1回のPCRで判定
※各々の増幅プライマーの組み合せ
・「WT」：At3g24730#143-F, drol1-1_HindIII
・「T-DNA = drol1-2」：At3g24730#143-F, LBb1.3
[C] drol1-1, drol1-2
※同時に判別する場合 		・At3g24730#143-F
・drol1-1_HindIII
・LBb1.3		 55℃ 2 min 「WT」「drol1-1」
185 bp

「T-DNA = drol1-2」
≒355 bp 		上記の[A][B]を組み合わせた検出方法
PCR後に制限酵素 Hind III で切って判別
HindIII処理後、(WT)185 bp　 (drol1-1)152 + 33 bp　 (drol1-2)≒355 bp
[D] drol1-2
※old ver. 上記推奨		 「WT」
・At3g24730#143-F
・anti6_At3724730
「T-DNA = drol1-2」
・At3g24730#143-F
・LBb1.3		 55℃ 2 min 「WT」
371 bp

「T-DNA = drol1-2」
≒355 bp 		各個体について、「WT」「T-DNA = drol1-2」の2種類のPCRを行った結果を合わせて判断。

このプライマーでは、「WT」「T-DNA = drol1-2」のバンドの長さの差が小さいため、上記[B]のようなプライマー3種類を混ぜたPCRでは判別できない


＜drol1-1変異体の判別（Hind III 処理）＞

1サンプル
滅菌水 5.7 µl
10xM Buffer 1 µl
Hind III 0.3 µl
PCR産物（上記参照） 3 µl
合計 10 µl
→　37℃で1～2時間反応


MultiNAで泳動し、バンドの長さを判別 　※Hind III処理後、(WT)185 bp 　(drol1-1)152 + 33 bp

＜各drol1変異体の変異箇所とプライマーの結合部位＞

Drol1 genotyping.png

drol1-1変異体と各sudl変異体の遺伝子マーカー

プライマーと制限酵素の組合せ

変異体 遺伝子名 PCRのプライマー プライマー配列 PCR断片長 制限酵素 制限酵素処理後の長さ
drol1-1
DROL1 At3g24730#143-F
drol1-1_dCAPS-HindIII		 TGATATCACGTTGTTTCCTTCG
GAAATGCACCAACCCATTTAGTATGATCCGAAGCT		 185 bp HindIII (WT) 185 bp
(drol1-1) 152+33 bp
sudl1-1
#8-5 		U5-40k m2g181F
m2g181R		 CAAGATACAATCACAGGTATGAGC
CACAGCTTTGAAATTCAGATCTCTC		 383 bp HaeIII (WT) 272+111 bp
(#8-5) 383 bp
sudl2-1
#47-1a 		PRP6 prp6_47-1aF
prp6_47-1aR		 GCTGAGGAGAAAAGGTACGATGAGA
CCTCTGATCAATAGACTCCCAGATGGCATCAAGCT		 135 bp HindIII (WT) 135 bp
(#47-1a) 102+33 bp
sudl3-1
#14-4 		PRP8 prp8_14-4F
prp8_14-4R		 CAACCCGCAGAAAAGCTACTGCAGTCCTCTCGATC
AGTGACTCTTTTGCATCTTGCTTG		 161 bp PvuI (WT) 128+33 bp
(#14-4) 161 bp
sudl3-2
#49-4a 		PRP8 prp8_49-4aF
prp8_49-4aR		 ATTCATACTTTATTAATTATAGACATTGAGCCACG
ATTCTTGGCGGACACATAGTCTGCAATATTGAGCT		 130 bp SacI (WT) 97+33 bp
(#49-4a) 130 bp
sudl3-3
#51-2a 		PRP8 prp8_51-2aF
prp8_51-2aR		 ACCTGAAAGATGGTCCGTATGTCACTCCAGACTAA
CTTTGTGTCATGTTTGTATGACAATGGAGGGAATG		 131 bp DdeI (WT) 97+34 bp
(#51-2a) 131 bp
sudl4-1
#40-2b 		SmBb smbb_40-2bF
smbb_40-2bR		 GCTTCAGTTCATCAACTACAGG
CTTCTTCCCTTTAGCTGGTGGTAGCTTACGAAGCT		 148 bp HindIII (WT) 148 bp
(#40-2b) 113+35 bp
sudl4-2
#43-2b 		SmBb smbb_43-2bF
smbb_43-2bR		 TCGTGCTAAAGCTGGCTCTGCAGCTGCTGTTGCGG
TCCACCAACACCACGAACAGGAC		 133 bp BamHI (WT) 133 bp
(#43-2b) 97+36 bp
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