遺伝子型判定時のマーカーの一覧
提供: 鈴木研Wiki
(版間での差分)
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== PCR == | == PCR == | ||
| − | === 反応液の組成 === | + | ==== 反応液の組成 ==== |
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|||1サンプル | |||1サンプル | ||
| 36行: | 36行: | ||
|} | |} | ||
| − | === 反応 === | + | ==== 反応 ==== |
# 95℃ 3分 | # 95℃ 3分 | ||
# [95℃ 45秒、(アニーリング)55℃ 45秒、(伸長反応)72℃ 2分] のサイクルを35回 | # [95℃ 45秒、(アニーリング)55℃ 45秒、(伸長反応)72℃ 2分] のサイクルを35回 | ||
| 43行: | 43行: | ||
== 制限酵素処理 == | == 制限酵素処理 == | ||
| − | === 反応液の組成 === | + | ==== 反応液の組成 ==== |
{| class='wikitable' | {| class='wikitable' | ||
|||1サンプル | |||1サンプル | ||
| 57行: | 57行: | ||
|合計||style="text-align:right;"|10 µl | |合計||style="text-align:right;"|10 µl | ||
|} | |} | ||
| − | === 反応 === | + | ==== 反応 ==== |
→ 37℃で1～2時間反応 | → 37℃で1～2時間反応 | ||
| − | + | ||
| + | == 解析 == | ||
MultiNA（あるいは、アガロースゲル）で電気泳動し、バンドの長さを判別 | MultiNA（あるいは、アガロースゲル）で電気泳動し、バンドの長さを判別 | ||
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</table> | </table> | ||
| − | + | == drol1変異体と各sudl変異体の遺伝子マーカー == | |
| − | == | + | |
==== プライマーと制限酵素の組合せ ==== | ==== プライマーと制限酵素の組合せ ==== | ||
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2023年8月4日 (金) 11:19時点における版
試薬
- 0.4M NaOH
- 0.1M Tris-HCl pH 6.8
DNA抽出 マルチビーズショッカー
- 葉を一枚切り取り、サンプル破砕用チューブに入れる
- ビーズを一粒入れる
- 40 µlの0.4M NaOHを入れる
- 2000rpmで5秒オン、2秒オフのサイクルを2回行う
- 遠心(フラッシュ)
- 200 µlの0.1M Tris-HClを加える
- よく混合し、遠心(フラッシュ)
- 上清を鋳型として用いる
PCR
反応液の組成
| 1サンプル | |
| ExTaq | 0.1 µl |
| 10×ExTaq Buffer | 2 µl |
| 2.5mM dNTP | 1.6 µl |
| プライマー | 終濃度0.2 µM |
| プライマー | 終濃度0.2 µM |
| DNA | 1 µl |
| 滅菌水 | up to 20 µl |
| 合計 | 20 µl |
反応
- 95℃ 3分
- [95℃ 45秒、(アニーリング)55℃ 45秒、(伸長反応)72℃ 2分] のサイクルを35回
- 72℃ 5分 (→ 4℃ ∞)
制限酵素処理
反応液の組成
| 1サンプル | |
| 滅菌水 | 5.7 µl |
| 10xM Buffer | 1 µl |
| Hind III | 0.3 µl |
| PCR産物（上記参照） | 3 µl |
| 合計 | 10 µl |
反応
→ 37℃で1～2時間反応
解析
MultiNA（あるいは、アガロースゲル）で電気泳動し、バンドの長さを判別
各drol1変異体の変異箇所とプライマーの結合部位
|
|
|
drol1変異体と各sudl変異体の遺伝子マーカー
プライマーと制限酵素の組合せ
| 変異体 | 遺伝子名 | PCRのプライマー | プライマー配列 | PCR断片長 | 制限酵素 | 制限酵素処理後の長さ |
|---|---|---|---|---|---|---|
| drol1-1 |
DROL1 | At3g24730#143-F drol1-1_dCAPS-HindIII |
TGATATCACGTTGTTTCCTTCG GAAATGCACCAACCCATTTAGTATGATCCGAAGCT |
185 bp | HindIII | (WT) 185 bp (drol1-1) 152+33 bp |
| drol1-2 |
DROL1 | At3g24730#143-F drol1-1_dCAPS-HindIII LBb1.3 |
TGATATCACGTTGTTTCCTTCG GAAATGCACCAACCCATTTAGTATGATCCGAAGCT ATTTTGCCGATTTCGGAAC |
(WT)185 bp (drol1-2)≒355 bp |
- | - |
| sudl1-1 #8-5 |
U5-40k | m2g181F m2g181R |
CAAGATACAATCACAGGTATGAGC CACAGCTTTGAAATTCAGATCTCTC |
383 bp | HaeIII | (WT) 272+111 bp (#8-5) 383 bp |
| sudl2-1 #47-1a |
PRP6 | prp6_47-1aF prp6_47-1aR |
GCTGAGGAGAAAAGGTACGATGAGA CCTCTGATCAATAGACTCCCAGATGGCATCAAGCT |
135 bp | HindIII | (WT) 135 bp (#47-1a) 102+33 bp |
| sudl3-1 #14-4 |
PRP8 | prp8_14-4F prp8_14-4R |
CAACCCGCAGAAAAGCTACTGCAGTCCTCTCGATC AGTGACTCTTTTGCATCTTGCTTG |
161 bp | PvuI | (WT) 128+33 bp (#14-4) 161 bp |
| sudl3-2 #49-4a |
PRP8 | prp8_49-4aF prp8_49-4aR |
ATTCATACTTTATTAATTATAGACATTGAGCCACG ATTCTTGGCGGACACATAGTCTGCAATATTGAGCT |
130 bp | SacI | (WT) 97+33 bp (#49-4a) 130 bp |
| sudl3-3 #51-2a |
PRP8 | prp8_51-2aF prp8_51-2aR |
ACCTGAAAGATGGTCCGTATGTCACTCCAGACTAA CTTTGTGTCATGTTTGTATGACAATGGAGGGAATG |
131 bp | DdeI | (WT) 97+34 bp (#51-2a) 131 bp |
| sudl4-1 #40-2b |
SmBb | smbb_40-2bF smbb_40-2bR |
GCTTCAGTTCATCAACTACAGG CTTCTTCCCTTTAGCTGGTGGTAGCTTACGAAGCT |
148 bp | HindIII | (WT) 148 bp (#40-2b) 113+35 bp |
| sudl4-2 #43-2b |
SmBb | smbb_43-2bF smbb_43-2bR |
TCGTGCTAAAGCTGGCTCTGCAGCTGCTGTTGCGG TCCACCAACACCACGAACAGGAC |
133 bp | BamHI | (WT) 133 bp (#43-2b) 97+36 bp |
