遺伝子型判定時のマーカーの一覧

提供: 鈴木研Wiki
(版間での差分)
移動: 案内, 検索
13行: 13行:
 
# よく混合し、遠心(フラッシュ)
 
# よく混合し、遠心(フラッシュ)
 
# 上清を鋳型として用いる
 
# 上清を鋳型として用いる
 +
  
 
== PCR ==
 
== PCR ==
18行: 19行:
  
 
<td>
 
<td>
 +
=== MightyAmp Ver.3 の場合 ===
 
{| class='wikitable'
 
{| class='wikitable'
 
|+ '''反応液の組成'''
 
|+ '''反応液の組成'''
−
|||1サンプル
+
! 試薬 !! 1サンプル分の量 !! 備考
 
|-
 
|-
−
|ExTaq||style="text-align:right;"|0.1 µl
+
|MightyAmp Ver3||style="text-align:right;"| 0.4 µl ||
 
|-
 
|-
−
|10×ExTaq Buffer||style="text-align:right;"|2 µl
+
|2×MightyAmp buffer Ver3 ||style="text-align:right;"| 10 µl ||
 +
|-
 +
|プライマー (Forward)||style="text-align:right;"| 終濃度0.3 µM || 10µMの場合、0.6 µl
 
|-
 
|-
−
|2.5mM dNTP||style="text-align:right;"|1.6 µl
+
|プライマー (Reverse)||style="text-align:right;"| 終濃度0.3 µM || 10µMの場合、0.6 µl
 
|-
 
|-
−
|プライマー||style="text-align:right;"|終濃度0.2 µM
+
|DNA||style="text-align:right;"| 1 µl ||
 
|-
 
|-
−
|プライマー||style="text-align:right;"|終濃度0.2 µM
+
|滅菌水||style="text-align:right;"| up to 20 µl ||
 
|-
 
|-
−
|DNA||style="text-align:right;"|1 µl
+
|合計||style="text-align:right;"| 20 µl ||
−
|-
+
−
|滅菌水||style="text-align:right;"| up to 20 µl
+
−
|-
+
−
|合計||style="text-align:right;"|20 µl
+
 
|}
 
|}
 +
 +
'''反応'''
 +
* 2step PCR
 +
#  98℃ 2分
 +
# [98℃ 10秒、(アニーリング + 伸長反応)68℃ 1分] のサイクルを35回
 +
 +
 +
* 3step PCR
 +
#  98℃ 2分
 +
# [98℃ 10秒、(アニーリング)60℃ 15秒、(伸長反応)68℃ 1分] のサイクルを35回
 +
 
</td>
 
</td>
  
 
<td>
 
<td>
 +
=== Ex Taq の場合 ===
 +
{| class='wikitable'
 +
|+ '''反応液の組成'''
 +
! 試薬 !! 1サンプル分の量 !! 備考
 +
|-
 +
|ExTaq||style="text-align:right;"| 0.1 µl ||
 +
|-
 +
|10×ExTaq Buffer||style="text-align:right;"| 2 µl ||
 +
|-
 +
|2.5mM dNTP||style="text-align:right;"| 1.6 µl ||
 +
|-
 +
|プライマー (Forward)||style="text-align:right;"| 終濃度 0.2 µM || 10µMの場合、0.4 µl
 +
|-
 +
|プライマー (Reverse)||style="text-align:right;"| 終濃度 0.2 µM || 10µMの場合、0.4 µl
 +
|-
 +
|DNA||style="text-align:right;"| 1 µl ||
 +
|-
 +
|滅菌水||style="text-align:right;"| up to 20 µl ||
 +
|-
 +
|合計||style="text-align:right;"| 20 µl ||
 +
|}
 +
 
'''反応'''
 
'''反応'''
 
#  95℃ 3分
 
#  95℃ 3分
49行: 82行:
 
</tr>
 
</tr>
 
</table>
 
</table>
 +
  
 
== 制限酵素処理 ==
 
== 制限酵素処理 ==

2023年8月4日 (金) 12:48時点における版

試薬

  • 0.4M NaOH
  • 0.1M Tris-HCl pH 6.8

DNA抽出 　マルチビーズショッカー

  1. 葉を一枚切り取り、サンプル破砕用チューブに入れる
  2. ビーズを一粒入れる
  3. 40 µlの0.4M NaOHを入れる
  4. 2000rpmで5秒オン、2秒オフのサイクルを2回行う
  5. 遠心(フラッシュ)
  6. 200 µlの0.1M Tris-HClを加える
  7. よく混合し、遠心(フラッシュ)
  8. 上清を鋳型として用いる


PCR

MightyAmp Ver.3 の場合

反応液の組成
試薬 1サンプル分の量 備考
MightyAmp Ver3 0.4 µl
2×MightyAmp buffer Ver3 10 µl
プライマー (Forward) 終濃度0.3 µM 10µMの場合、0.6 µl
プライマー (Reverse) 終濃度0.3 µM 10µMの場合、0.6 µl
DNA 1 µl
滅菌水 up to 20 µl
合計 20 µl

反応

  • 2step PCR
  1. 98℃ 2分
  2. [98℃ 10秒、(アニーリング + 伸長反応)68℃ 1分] のサイクルを35回


  • 3step PCR
  1. 98℃ 2分
  2. [98℃ 10秒、(アニーリング)60℃ 15秒、(伸長反応)68℃ 1分] のサイクルを35回

Ex Taq の場合

反応液の組成
試薬 1サンプル分の量 備考
ExTaq 0.1 µl
10×ExTaq Buffer 2 µl
2.5mM dNTP 1.6 µl
プライマー (Forward) 終濃度 0.2 µM 10µMの場合、0.4 µl
プライマー (Reverse) 終濃度 0.2 µM 10µMの場合、0.4 µl
DNA 1 µl
滅菌水 up to 20 µl
合計 20 µl

反応

  1. 95℃ 3分
  2. [95℃ 45秒、(アニーリング)55℃ 45秒、(伸長反応)72℃ 2分] のサイクルを35回
  3. 72℃ 5分 (→ 4℃ ∞)


制限酵素処理

反応液の組成
1サンプル
滅菌水 5.7 µl
10xM Buffer 1 µl
Hind III 0.3 µl
PCR産物（上記参照） 3 µl
合計 10 µl

反応
→　37℃で1～2時間反応

解析

MultiNA（あるいは、アガロースゲル）で電気泳動し、バンドの長さを判別


各drol1変異体の変異箇所とプライマーの結合部位

Drol1 genotyping.png

  • WT (DROL1)
    • PCR：プライマー(1)+(2)で増幅（185bp）
    • HindIII処理後（185bpのまま）
  • drol1-1
    • PCRプライマー：(1)+(2)で増幅（185bp）
    • HindIII処理後（152+33bp）
  • drol1-2
    • PCRプライマー：(1)+(3)で増幅（≒355bp）
    • HindIII処理後（≒355bpのまま）

drol1変異体と各sudl変異体の遺伝子マーカー

プライマーと制限酵素の組合せ

変異体 遺伝子名 PCRのプライマー プライマー配列 PCR断片長 制限酵素 制限酵素処理後の長さ
drol1-1
DROL1 At3g24730#143-F
drol1-1_dCAPS-HindIII		 TGATATCACGTTGTTTCCTTCG
GAAATGCACCAACCCATTTAGTATGATCCGAAGCT		 185 bp HindIII (WT) 185 bp
(drol1-1) 152+33 bp
drol1-2
DROL1 At3g24730#143-F
drol1-1_dCAPS-HindIII
LBb1.3 		TGATATCACGTTGTTTCCTTCG
GAAATGCACCAACCCATTTAGTATGATCCGAAGCT
ATTTTGCCGATTTCGGAAC 		(WT)185 bp
(drol1-2)≒355 bp		 - -
sudl1-1
#8-5 		U5-40k m2g181F
m2g181R		 CAAGATACAATCACAGGTATGAGC
CACAGCTTTGAAATTCAGATCTCTC		 383 bp HaeIII (WT) 272+111 bp
(#8-5) 383 bp
sudl2-1
#47-1a 		PRP6 prp6_47-1aF
prp6_47-1aR		 GCTGAGGAGAAAAGGTACGATGAGA
CCTCTGATCAATAGACTCCCAGATGGCATCAAGCT		 135 bp HindIII (WT) 135 bp
(#47-1a) 102+33 bp
sudl3-1
#14-4 		PRP8 prp8_14-4F
prp8_14-4R		 CAACCCGCAGAAAAGCTACTGCAGTCCTCTCGATC
AGTGACTCTTTTGCATCTTGCTTG		 161 bp PvuI (WT) 128+33 bp
(#14-4) 161 bp
sudl3-2
#49-4a 		PRP8 prp8_49-4aF
prp8_49-4aR		 ATTCATACTTTATTAATTATAGACATTGAGCCACG
ATTCTTGGCGGACACATAGTCTGCAATATTGAGCT		 130 bp SacI (WT) 97+33 bp
(#49-4a) 130 bp
sudl3-3
#51-2a 		PRP8 prp8_51-2aF
prp8_51-2aR		 ACCTGAAAGATGGTCCGTATGTCACTCCAGACTAA
CTTTGTGTCATGTTTGTATGACAATGGAGGGAATG		 131 bp DdeI (WT) 97+34 bp
(#51-2a) 131 bp
sudl4-1
#40-2b 		SmBb smbb_40-2bF
smbb_40-2bR		 GCTTCAGTTCATCAACTACAGG
CTTCTTCCCTTTAGCTGGTGGTAGCTTACGAAGCT		 148 bp HindIII (WT) 148 bp
(#40-2b) 113+35 bp
sudl4-2
#43-2b 		SmBb smbb_43-2bF
smbb_43-2bR		 TCGTGCTAAAGCTGGCTCTGCAGCTGCTGTTGCGG
TCCACCAACACCACGAACAGGAC		 133 bp BamHI (WT) 133 bp
(#43-2b) 97+36 bp
「https://www.tsbio.info/labowiki/index.php?title=%E9%81%BA%E4%BC%9D%E5%AD%90%E5%9E%8B%E5%88%A4%E5%AE%9A%E6%99%82%E3%81%AE%E3%83%9E%E3%83%BC%E3%82%AB%E3%83%BC%E3%81%AE%E4%B8%80%E8%A6%A7&oldid=795」から取得
個人用ツール
名前空間

変種
操作
案内
ツール