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| − | __NOTOC__
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| − | == 試薬 ==
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| − | * 0.4M NaOH
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| − | * 0.1M Tris-HCl pH 6.8
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| − | == DNA抽出 マルチビーズショッカー==
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| − | # 葉を一枚切り取り、サンプル破砕用チューブに入れる
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| − | # ビーズを一粒入れる
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| − | # 40 µlの0.4M NaOHを入れる
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| − | # 2000rpmで5秒オン、2秒オフのサイクルを2回行う
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| − | # 遠心(フラッシュ)
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| − | # 200 µlの0.1M Tris-HClを加える
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| − | # よく混合し、遠心(フラッシュ)
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| − | # 上清を鋳型として用いる
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| − | == PCR ==
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| − | === 反応液の組成 ===
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| − | {| class='wikitable'
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| − | |||1サンプル
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| − | |ExTaq||style="text-align:right;"|0.1 µl
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| − | |-
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| − | |10×ExTaq Buffer||style="text-align:right;"|2 µl
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| − | |-
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| − | |2.5mM dNTP||style="text-align:right;"|1.6 µl
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| − | |-
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| − | |プライマー||style="text-align:right;"|終濃度0.2 µM
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| − | |-
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| − | |プライマー||style="text-align:right;"|終濃度0.2 µM
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| − | |-
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| − | |DNA||style="text-align:right;"|1 µl
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| − | |-
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| − | |滅菌水||style="text-align:right;"| up to 20 µl
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| − | |-
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| − | |合計||style="text-align:right;"|20 µl
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| − | |}
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| − | === 反応 ===
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| − | # 95℃ 3分
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| − | # [95℃ 45秒、(アニーリング)55℃ 45秒、(伸長反応)72℃ 2分] のサイクルを35回
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| − | # 72℃ 5分 (→ 4℃ ∞)
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| − | ==== ＜drol1変異体の判別方法＞ ====
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| − | {| class="wikitable"
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| − | ! !! 判定する<br>遺伝子型 !! プライマーの組み合せ !! アニーリング温度 !! 伸長時間 !! PCR後の<br>バンドの長さ !! 備考
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| − | | width="5pt" |'''[A]''' || width="50pt" |'''drol1-1''' || width="120pt" |・At3g24730#143-F <br>・drol1-1_HindIII || 55℃ || 1 min でOK || width="110pt" |(185 bp) || このPCR産物をさらに制限酵素 Hind III で切って判別 ※方法は下記参照<br> '''HindIII処理後、(WT)185 bp (drol1-1)152 + 33 bp'''
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| − | |-
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| − | | '''[B]''' || '''drol1-2''' ||・At3g24730#143-F <br>・drol1-1_HindIII <br>・LBb1.3|| 55℃ || 2 min || '''「WT」<br>185 bp<br><br>「T-DNA = drol1-2」<br>≒355 bp''' || プライマー3種類を混ぜて、「WT」「T-DNA = drol1-2」の判別を1回のPCRで判定 <br>※各々の増幅プライマーの組み合せ<br>・「WT」：At3g24730#143-F, drol1-1_HindIII <br>・「T-DNA = drol1-2」：At3g24730#143-F, LBb1.3
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| − | |-
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| − | | '''[C]''' || '''drol1-1, drol1-2''' <br>※同時に判別する場合 ||・At3g24730#143-F <br>・drol1-1_HindIII <br>・LBb1.3|| 55℃ || 2 min || 「WT」「drol1-1」<br>185 bp<br><br>「T-DNA = drol1-2」<br>≒355 bp || 上記の[A][B]を組み合わせた検出方法 <br> PCR後に制限酵素 Hind III で切って判別 <br>'''HindIII処理後、(WT)185 bp (drol1-1)152 + 33 bp (drol1-2)≒355 bp'''
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| − | | '''[D]''' || '''drol1-2''' <br>※old ver. 上記推奨||「WT」<br>・At3g24730#143-F <br>・anti6_At3724730 <br> 「T-DNA = drol1-2」 <br>・At3g24730#143-F <br>・LBb1.3|| 55℃ || 2 min || 「WT」<br>371 bp<br><br>「T-DNA = drol1-2」<br>≒355 bp || 各個体について、「WT」「T-DNA = drol1-2」の2種類のPCRを行った結果を合わせて判断。 <br><br>このプライマーでは、「WT」「T-DNA = drol1-2」のバンドの長さの差が小さいため、上記[B]のようなプライマー3種類を混ぜたPCRでは判別できない
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| − | |}
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| − | ==== ＜drol1-1変異体の判別（Hind III 処理）＞ ====
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| − | {| class='wikitable'
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| − | |||1サンプル
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| − | |滅菌水||style="text-align:right;"| 5.7 µl
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| − | |-
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| − | |10xM Buffer||style="text-align:right;"|1 µl
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| − | |-
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| − | |Hind III||style="text-align:right;"|0.3 µl
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| − | |-
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| − | |PCR産物（上記参照）||style="text-align:right;"|3 µl
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| − | |-
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| − | |合計||style="text-align:right;"|10 µl
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| − | |}→ 37℃で1～2時間反応
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| − | <br> MultiNAで泳動し、バンドの長さを判別
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| − | ※Hind III処理後、(WT)185 bp (drol1-1)152 + 33 bp
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| − | ==== ＜各drol1変異体の変異箇所とプライマーの結合部位＞ ====
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| − | <table border="0">
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| − | <tr>
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| − | <td>
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| − | [[ファイル:drol1_genotyping.png]]
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| − | </td>
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| − | <td>
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| − | *'''WT (DROL1)'''
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| − | **PCR：プライマー(1)+(2)で増幅（185bp）
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| − | **HindIII処理後（185bpのまま）
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| − |
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| − | *'''drol1-1'''
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| − | **PCRプライマー：(1)+(2)で増幅（185bp）
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| − | **HindIII処理後（152+33bp）
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| − |
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| − | *'''drol1-2'''
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| − | **PCRプライマー：(1)+(3)で増幅（≒355bp）
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| − | **HindIII処理後（≒355bpのまま）
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| − | </td>
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| − |
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| − | </tr>
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| − | </table>
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| − | == drol1-1変異体と各sudl変異体の遺伝子マーカー ==
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| − | ==== プライマーと制限酵素の組合せ ====
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| − | {| class="wikitable" style="width:90%"
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| − | ! 変異体 !! 遺伝子名 !! PCRのプライマー !! プライマー配列 !! PCR断片長 !! 制限酵素 !! 制限酵素処理後の長さ
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| − | |-
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| − | ! drol1-1 <br>
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| − | | DROL1|| At3g24730#143-F <br> drol1-1_dCAPS-HindIII|| TGATATCACGTTGTTTCCTTCG <br> GAAATGCACCAACCCATTTAGTATGATCCGAAGCT|| 185 bp|| HindIII|| (WT) 185 bp <br> (drol1-1) 152+33 bp
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| − | |-
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| − | ! drol1-2 <br>
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| − | | DROL1|| At3g24730#143-F <br> drol1-1_dCAPS-HindIII <br> LBb1.3 || TGATATCACGTTGTTTCCTTCG <br> GAAATGCACCAACCCATTTAGTATGATCCGAAGCT <br> ATTTTGCCGATTTCGGAAC || (WT)185 bp <br> (drol1-2)≒355 bp|| - || -
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| − | |-
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| − | ! sudl1-1 <br> #8-5
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| − | | U5-40k|| m2g181F <br> m2g181R|| CAAGATACAATCACAGGTATGAGC <br> CACAGCTTTGAAATTCAGATCTCTC|| 383 bp|| HaeIII|| (WT) 272+111 bp <br> (#8-5) 383 bp
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| − | |-
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| − | ! sudl2-1 <br> #47-1a
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| − | | PRP6|| prp6_47-1aF <br> prp6_47-1aR|| GCTGAGGAGAAAAGGTACGATGAGA <br> CCTCTGATCAATAGACTCCCAGATGGCATCAAGCT|| 135 bp|| HindIII|| (WT) 135 bp <br> (#47-1a) 102+33 bp
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| − | |-
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| − | ! sudl3-1 <br> #14-4
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| − | | PRP8|| prp8_14-4F <br> prp8_14-4R|| CAACCCGCAGAAAAGCTACTGCAGTCCTCTCGATC <br> AGTGACTCTTTTGCATCTTGCTTG|| 161 bp|| PvuI|| (WT) 128+33 bp <br> (#14-4) 161 bp
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| − | |-
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| − | ! sudl3-2 <br> #49-4a
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| − | | PRP8|| prp8_49-4aF <br> prp8_49-4aR|| ATTCATACTTTATTAATTATAGACATTGAGCCACG <br> ATTCTTGGCGGACACATAGTCTGCAATATTGAGCT|| 130 bp|| SacI|| (WT) 97+33 bp <br> (#49-4a) 130 bp
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| − | |-
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| − | ! sudl3-3 <br> #51-2a
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| − | | PRP8|| prp8_51-2aF <br> prp8_51-2aR|| ACCTGAAAGATGGTCCGTATGTCACTCCAGACTAA <br> CTTTGTGTCATGTTTGTATGACAATGGAGGGAATG|| 131 bp|| DdeI|| (WT) 97+34 bp <br> (#51-2a) 131 bp
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| − | |-
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| − | ! sudl4-1 <br> #40-2b
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| − | | SmBb|| smbb_40-2bF <br> smbb_40-2bR|| GCTTCAGTTCATCAACTACAGG <br> CTTCTTCCCTTTAGCTGGTGGTAGCTTACGAAGCT|| 148 bp|| HindIII|| (WT) 148 bp <br> (#40-2b) 113+35 bp
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| − | |-
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| − | ! sudl4-2 <br> #43-2b
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| − | | SmBb|| smbb_43-2bF <br> smbb_43-2bR|| TCGTGCTAAAGCTGGCTCTGCAGCTGCTGTTGCGG <br> TCCACCAACACCACGAACAGGAC|| 133 bp|| BamHI|| (WT) 133 bp <br> (#43-2b) 97+36 bp
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| − | |}
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