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− | __NOTOC__
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− | == (1) DNA抽出 (マルチビーズショッカー) ==
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− | ==== 試薬 ====
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− | * 0.4M NaOH
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− | * 0.1M Tris-HCl pH 6.8
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− | ==== 手順 ====
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− | # 葉を一枚切り取り、サンプル破砕用チューブに入れる
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− | # ビーズを一粒入れる
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− | # 40 µlの0.4M NaOHを入れる
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− | # 2000rpmで5秒オン、2秒オフのサイクルを2回行う
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− | # 遠心(フラッシュ)
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− | # 200 µlの0.1M Tris-HClを加える
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− | # よく混合し、遠心(フラッシュ)
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− | # 上清を鋳型として用いる
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− | == (2) PCR ==
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− | <table border="0"><tr>
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− | <td>
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− | ==== MightyAmp Ver.3 の場合 ====
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− | {| class='wikitable'
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− | |+ '''反応液の組成'''
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− | ! 試薬 !! 1サンプル分の量 !! 備考
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− | |-
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− | |MightyAmp Ver3||style="text-align:right;"| 0.4 µl ||
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− | |-
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− | |2×MightyAmp buffer Ver3 ||style="text-align:right;"| 10 µl ||
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− | |-
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− | |プライマー (Forward)||style="text-align:right;"| 終濃度0.3 µM || 10µMの場合、0.6 µl
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− | |-
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− | |プライマー (Reverse)||style="text-align:right;"| 終濃度0.3 µM || 10µMの場合、0.6 µl
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− | |-
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− | |DNA||style="text-align:right;"| 1 µl ||
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− | |-
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− | |滅菌水||style="text-align:right;"| up to 20 µl ||
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− | |-
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− | |合計||style="text-align:right;"| 20 µl ||
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− | |}
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− | '''反応'''
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− | * 2step PCR
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− | # 98℃ 2分
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− | # [98℃ 10秒、(アニーリング + 伸長反応)68℃ 1分] のサイクルを35回
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− | * 3step PCR
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− | # 98℃ 2分
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− | # [98℃ 10秒、(アニーリング)60℃ 15秒、(伸長反応)68℃ 1分] のサイクルを35回
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− | </td>
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− | <td>
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− | ==== Ex Taq の場合 ====
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− | {| class='wikitable'
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− | |+ '''反応液の組成'''
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− | ! 試薬 !! 1サンプル分の量 !! 備考
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− | |-
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− | |ExTaq||style="text-align:right;"| 0.1 µl ||
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− | |-
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− | |10×ExTaq Buffer||style="text-align:right;"| 2 µl ||
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− | |-
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− | |2.5mM dNTP||style="text-align:right;"| 1.6 µl ||
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− | |-
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− | |プライマー (Forward)||style="text-align:right;"| 終濃度 0.2 µM || 10µMの場合、0.4 µl
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− | |-
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− | |プライマー (Reverse)||style="text-align:right;"| 終濃度 0.2 µM || 10µMの場合、0.4 µl
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− | |-
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− | |DNA||style="text-align:right;"| 1 µl ||
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− | |-
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− | |滅菌水||style="text-align:right;"| up to 20 µl ||
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− | |-
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− | |合計||style="text-align:right;"| 20 µl ||
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− | |}
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− | '''反応'''
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− | # 95℃ 3分
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− | # [95℃ 45秒、(アニーリング)55℃ 45秒、(伸長反応)72℃ 2分] のサイクルを35回
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− | # 72℃ 5分 (→ 4℃ ∞)
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− | </td>
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− | </tr>
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− | </table>
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− | == (3) 制限酵素処理 ==
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− | <table border="0">
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− | <tr>
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− | <td>
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− | {| class='wikitable'
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− | |+ '''反応液の組成'''
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− | |||1サンプル
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− | |-
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− | |滅菌水||style="text-align:right;"| 5.7 µl
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− | |-
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− | |10x Buffer||style="text-align:right;"|1 µl
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− | |-
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− | |制限酵素||style="text-align:right;"|0.3 µl
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− | |-
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− | |PCR産物(上記参照)||style="text-align:right;"|3 µl
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− | |-
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− | |合計||style="text-align:right;"|10 µl
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− | |}
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− | </td>
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− | <td>
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− | '''反応'''
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− | <br> → 37℃で1~2時間反応
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− | </td>
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− | </tr>
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− | </table>
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− | == (4) 解析 ==
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− | MultiNA(あるいは、アガロースゲル)で電気泳動し、バンドの長さを判別
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− | == < 各drol1変異体の変異箇所とプライマーの結合部位 > ==
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− | <table border="0">
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− | <tr>
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− | <td>
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− | [[ファイル:drol1_genotyping.png]]
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− | </td>
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− | <td>
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− | *'''WT (DROL1)'''
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− | **PCR:プライマー(1)+(2)で増幅(185bp)
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− | **HindIII処理後(185bpのまま)
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− |
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− | *'''drol1-1'''
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− | **PCRプライマー:(1)+(2)で増幅(185bp)
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− | **HindIII処理後(152+33bp)
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− |
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− | *'''drol1-2'''
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− | **PCRプライマー:(1)+(3)で増幅(≒355bp)
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− | **HindIII処理後(≒355bpのまま)
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− | </td>
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− |
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− | </tr>
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− | </table>
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− | == < drol1変異体と各sudl変異体の遺伝子マーカー > ==
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− | ==== プライマーと制限酵素の組合せ ====
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− | {| class="wikitable" style="width:100%"
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− | ! 変異体 !! 遺伝子名 !! PCRのプライマー !! プライマー配列 !! PCR断片長 !! 制限酵素 !! 制限酵素処理後の長さ
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− | |-
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− | ! drol1-1 <br>
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− | | DROL1|| At3g24730#143-F <br> drol1-1_dCAPS-HindIII|| TGATATCACGTTGTTTCCTTCG <br> GAAATGCACCAACCCATTTAGTATGATCCGAAGCT|| 185 bp|| HindIII|| (WT) 185 bp <br> (drol1-1) 152+33 bp
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− | |-
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− | ! drol1-2 <br>
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− | | DROL1|| At3g24730#143-F <br> drol1-1_dCAPS-HindIII <br> LBb1.3 || TGATATCACGTTGTTTCCTTCG <br> GAAATGCACCAACCCATTTAGTATGATCCGAAGCT <br> ATTTTGCCGATTTCGGAAC || (WT)185 bp <br> (drol1-2)≒355 bp|| - || -
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− | |-
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− | ! sudl1-1 <br> #8-5
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− | | U5-40k|| m2g181F <br> m2g181R|| CAAGATACAATCACAGGTATGAGC <br> CACAGCTTTGAAATTCAGATCTCTC|| 383 bp|| HaeIII|| (WT) 272+111 bp <br> (#8-5) 383 bp
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− | |-
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− | ! sudl2-1 <br> #47-1a
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− | | PRP6|| prp6_47-1aF <br> prp6_47-1aR|| GCTGAGGAGAAAAGGTACGATGAGA <br> CCTCTGATCAATAGACTCCCAGATGGCATCAAGCT|| 135 bp|| HindIII|| (WT) 135 bp <br> (#47-1a) 102+33 bp
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− | |-
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− | ! sudl3-1 <br> #14-4
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− | | PRP8|| prp8_14-4F <br> prp8_14-4R|| CAACCCGCAGAAAAGCTACTGCAGTCCTCTCGATC <br> AGTGACTCTTTTGCATCTTGCTTG|| 161 bp|| PvuI|| (WT) 128+33 bp <br> (#14-4) 161 bp
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− | |-
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− | ! sudl3-2 <br> #49-4a
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− | | PRP8|| prp8_49-4aF <br> prp8_49-4aR|| ATTCATACTTTATTAATTATAGACATTGAGCCACG <br> ATTCTTGGCGGACACATAGTCTGCAATATTGAGCT|| 130 bp|| SacI|| (WT) 97+33 bp <br> (#49-4a) 130 bp
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− | ! sudl3-3 <br> #51-2a
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− | | PRP8|| prp8_51-2aF <br> prp8_51-2aR|| ACCTGAAAGATGGTCCGTATGTCACTCCAGACTAA <br> CTTTGTGTCATGTTTGTATGACAATGGAGGGAATG|| 131 bp|| DdeI|| (WT) 97+34 bp <br> (#51-2a) 131 bp
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− | ! sudl4-1 <br> #40-2b
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− | | SmBb|| smbb_40-2bF <br> smbb_40-2bR|| GCTTCAGTTCATCAACTACAGG <br> CTTCTTCCCTTTAGCTGGTGGTAGCTTACGAAGCT|| 148 bp|| HindIII|| (WT) 148 bp <br> (#40-2b) 113+35 bp
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− | |-
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− | ! sudl4-2 <br> #43-2b
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− | | SmBb|| smbb_43-2bF <br> smbb_43-2bR|| TCGTGCTAAAGCTGGCTCTGCAGCTGCTGTTGCGG <br> TCCACCAACACCACGAACAGGAC|| 133 bp|| BamHI|| (WT) 133 bp <br> (#43-2b) 97+36 bp
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