トマトSNPマーカーのライブラリ化
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| − | == | + | == PCR産物のリン酸化== |
| − | {| | + | #以下のように試薬を混ぜる |
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| − | + | |PCR 産物 | |
| + | |style="text-align:right;"|8.5 µl | ||
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| − | + | |T4 Polynucleotide Kinase | |
| + | |style="text-align:right;"|0.5 µl | ||
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| − | | | + | |10x Buffer for T4 DNA Ligase |
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| + | |バッファーはDNA Ligaseのものを使用(ATPが入っている) | ||
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| + | # 37℃で30分間保温する。 | ||
| + | # 65℃で20分間保温する。 | ||
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| + | == Loop Adapterを結合 == | ||
| + | #以下のように試薬を混ぜる | ||
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| + | |リン酸化PCR 産物 | ||
| + | |style="text-align:right;"|5 µl | ||
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| + | |1.5 µM Loop Adapter | ||
| + | |style="text-align:right;"|0.5 µl | ||
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| + | |T4 DNA Ligase (NEB 2,000,000 unit/ml) | ||
| + | |style="text-align:right;"|0.5 µl | ||
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| + | # 20 ℃で15分間保温する。 | ||
| + | # 70℃で10分間保温する。 | ||
| + | # 0.5 µl USERを添加する。 | ||
| + | # 37℃で15分間保温する。 | ||
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| + | == AMPureで精製 == | ||
| + | # よく懸濁したAMPure XPをDNAと等量加える。よく混ぜたあと、室温で5分間静置する。 | ||
| + | # 遠心してビーズを沈殿させたあと、磁性スタンドに立てて2分間静置する。 | ||
| + | # スタンドに立てたまま上清を除く。 | ||
| + | # 200µl 70% EtOHを加え、上清を除く。これを2回行う。 | ||
| + | # 遠心してビーズを沈殿させ、磁性スタンドに立てる。そこにたまったEtOHを除く。 | ||
| + | # 5分間蓋をあけたまま乾燥させる。 | ||
| + | # 27.5 µl RSAを加えて、懸濁する。2分間待つ。遠心後磁性スタンドに立て、25 µl 上清を回収する。 | ||
| + | # もう一度AMPureで精製する。25 µl 上清を回収する。 | ||
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| + | == PCR増幅 == | ||
| + | # 終濃度0.5µMになるようにUniversal PCR Primerと適当なIndex Primerを使って全量50µlでPCRを行う。 | ||
| + | # AMPure 50µlを加えてDNAを精製する。RSB 30µlでDNAを回収する。 | ||
2017年2月22日 (水) 11:44時点における最新版
目次 |
[編集] PCR産物のリン酸化
- 以下のように試薬を混ぜる
| PCR 産物 | 8.5 µl | |
| T4 Polynucleotide Kinase | 0.5 µl | |
| 10x Buffer for T4 DNA Ligase | 1µl | バッファーはDNA Ligaseのものを使用(ATPが入っている) |
- 37℃で30分間保温する。
- 65℃で20分間保温する。
[編集] Loop Adapterを結合
- 以下のように試薬を混ぜる
| リン酸化PCR 産物 | 5 µl |
| 1.5 µM Loop Adapter | 0.5 µl |
| T4 DNA Ligase (NEB 2,000,000 unit/ml) | 0.5 µl |
- 20 ℃で15分間保温する。
- 70℃で10分間保温する。
- 0.5 µl USERを添加する。
- 37℃で15分間保温する。
[編集] AMPureで精製
- よく懸濁したAMPure XPをDNAと等量加える。よく混ぜたあと、室温で5分間静置する。
- 遠心してビーズを沈殿させたあと、磁性スタンドに立てて2分間静置する。
- スタンドに立てたまま上清を除く。
- 200µl 70% EtOHを加え、上清を除く。これを2回行う。
- 遠心してビーズを沈殿させ、磁性スタンドに立てる。そこにたまったEtOHを除く。
- 5分間蓋をあけたまま乾燥させる。
- 27.5 µl RSAを加えて、懸濁する。2分間待つ。遠心後磁性スタンドに立て、25 µl 上清を回収する。
- もう一度AMPureで精製する。25 µl 上清を回収する。
[編集] PCR増幅
- 終濃度0.5µMになるようにUniversal PCR Primerと適当なIndex Primerを使って全量50µlでPCRを行う。
- AMPure 50µlを加えてDNAを精製する。RSB 30µlでDNAを回収する。
