NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit

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# DNA 1 µg / 52.5 µl に調整する。  
 
# DNA 1 µg / 52.5 µl に調整する。  
 
# Covaris S2で断片化する。
 
# Covaris S2で断片化する。
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- 古田(内線5548に電話する。装置の電源を入れておいてくれる)。
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* 古田(内線5548に電話する。装置の電源を入れておいてくれる)。
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- DNA300bp micro Tube 130µl Holder XTUの設定を使用する。以下の設定は過去の記録で、現在の設定と同じかどうか不明。
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* DNA300bp micro Tube 130µl Holder XTUの設定を使用する。以下の設定は過去の記録で、現在の設定と同じかどうか不明。
 
{| class='wikitable'
 
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|+ Covarisの設定
 
|+ Covarisの設定
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=== アダプターのライゲーション (約1時間) ===
 
=== アダプターのライゲーション (約1時間) ===
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# 2.5 µl アダプター原液(最初のDNAが100ng以下の場合は、希釈する。マニュアル参照)を加える。
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# 2.5 µl アダプター原液を加える。最初のDNAが100ng以下の場合は希釈する(マニュアル参照)。
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# 1 µl NEBNext Ligation Enhancer、30 µl NEBNext Ultra II Ligation Master Mixを加える。
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# 30 µl NEBNext Ultra II Ligation Master Mixを加える。
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# 1 µl NEBNext Ligation Enhancerを加える。
 
# 10回ピペッティングで混ぜる。
 
# 10回ピペッティングで混ぜる。
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# 30℃で10分間、インキュベートする。
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# 20℃で15分間、インキュベートする。
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# 5µl Stop Ligase Mixを加える。10回ピペッティングで混ぜる。
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# 3 µl USER Enzymeを加える(ピペットの目盛りは2.5µl)。10回ピペッティングで混ぜる。
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# Sample Purification Beads (42.5 µl)を加え、精製する(上のDNA精製と同じ)。52.5 µl RSBを加え、50 µl 回収する。ここで止められる(-20℃)。
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# 37℃で15分間、インキュベートする。
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# Sample Purification Beads (50 µl)を加え、もう一度精製する。27.5 µl RSBを加え、25 µl をPCR用のチューブへ回収する。
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=== サイズ分画 (約0.5時間) ===
 
=== サイズ分画 (約0.5時間) ===
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# Sample Purification Beadsと水を以下のように混ぜる。
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# 25 µl AMPureXPを加え、よく撹拌して、5分間室温で放置する。
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## DNAの長さ350bpのとき、Sample Purification Beads 60 µl、水 40 µl  
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## DNAの長さ550bpのとき、Sample Purification Beads 50 µl、水 50 µl
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−
# 希釈したSample Purification Beads 80 µl(標準プロトコール160µlの半分)を加え、よく撹拌して、5分間室温で放置する。
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# 遠心後、磁性スタンドに立て、上清を'''回収'''する。
 
# 遠心後、磁性スタンドに立て、上清を'''回収'''する。
−
# Sample Purification Beads 15 µl(標準プロトコール30µlの半分)を加え、よく撹拌して、5分間室温で放置する。
+
# 10 µl AMPureXPを加え、よく撹拌して、5分間室温で放置する。
 
# 遠心して上清を捨てる。
 
# 遠心して上清を捨てる。
−
# 200 µl 80%エタノールを加え、30秒後、上清を捨てる。スタンドから外して混ぜたりする必要はない。2回行う。
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# 200 µl 80%エタノールを加え、30秒後、上清を捨てる。スタンドから外して混ぜたりする必要はない。2回行う。
 
# 遠心して上清を捨てたあと、5分間乾燥させる。
 
# 遠心して上清を捨てたあと、5分間乾燥させる。
−
# 20 µl Resuspension Bufferを加え、懸濁する。2分室温で放置する。
+
# 17 µl 0.1 x TEを加え、懸濁する。2分室温で放置する。
−
# 上清 17.5 µl を回収する。ここで止められる(-20℃)。
+
# 上清 15 µl を回収する。ここで止められる(-20℃)。
  
 
=== PCR (約1.5時間) ===
 
=== PCR (約1.5時間) ===
−
# 5 µl PCR Primer Cocktailを加える。25 µl PCR Master Mixを加える。初めて使用するときはPCR Master Mixを200 µlずつ小分けする。
+
# 5 µl Universal PCR primer、5 µl Index primer、25 µl NEBNext Ultra II Q5 Master Mixを加える。全体で50 µlになる。
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# 95℃で3分、(98℃で20秒、60℃で15秒、72℃で30秒) x 8 cycle、72℃で5分、のPCRを行う。
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# 98℃で30秒、(98℃で10秒、65℃で75秒) x 6 cycle、65℃で5分、のPCRを行う。
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# Sample Purification Beads (50 µl)を加え、精製する。32.5 µl RSBを加え、30 µl 回収する。ここで止められる(-20℃)。
+
# 45 µl KAPA Hyper Pure Beads を加え、を加え、精製する。32.5 µl 0.1 x TEを加え、30 µl 回収する。ここで止められる(-20℃)。

2024年4月20日 (土) 11:41時点における最新版

目次

[編集] DNA断片化 (約1時間)

  1. DNA 1 µg / 52.5 µl に調整する。
  2. Covaris S2で断片化する。
  • 古田(内線5548に電話する。装置の電源を入れておいてくれる)。
  • DNA300bp micro Tube 130µl Holder XTUの設定を使用する。以下の設定は過去の記録で、現在の設定と同じかどうか不明。
Covarisの設定
DNAの長さ(目標) 350bp 550 bp
Duty Cycle 10%
Intensity 5 2
Cycles per Burst 200
Time (duration) 45
Mode Frequency sweeping
  1. DNA溶液 50 µl を回収する。

[編集] DNA精製

  1. KAPA Hyper Pure Beads を80 µl加える。よく撹拌して、5分間室温で放置する。
  2. 遠心後、磁性スタンドに立て、上清を捨てる。
  3. 200 µl 80%エタノールを加え、30秒後、上清を捨てる。スタンドから外して混ぜたりする必要はない。2回行う。
  4. 遠心して上清を捨てたあと、5分間乾燥させる。
  5. 53 µl 0.1 x TEを加え、懸濁する。2分室温で放置する。
  6. 遠心後、磁性スタンドに立て、上清 50 µl を回収する。

[編集] 末端整形 (約1.1時間)

  1. 7 µl NEBNext UltraII End Prep Reaction Buf.と3 µl Enzyme Mixを加える(Enzyme Mixは粘性が高いのでピペットの目盛りは2µlにする)。10回ピペッティングで混ぜる。
  2. 20℃で30分間、インキュベートする。
  3. 65℃で30分間、インキュベートする。

[編集] アダプターのライゲーション (約1時間)

  1. 2.5 µl アダプター原液を加える。最初のDNAが100ng以下の場合は希釈する(マニュアル参照)。
  2. 30 µl NEBNext Ultra II Ligation Master Mixを加える。
  3. 1 µl NEBNext Ligation Enhancerを加える。
  4. 10回ピペッティングで混ぜる。
  5. 20℃で15分間、インキュベートする。
  6. 3 µl USER Enzymeを加える(ピペットの目盛りは2.5µl)。10回ピペッティングで混ぜる。
  7. 37℃で15分間、インキュベートする。

[編集] サイズ分画 (約0.5時間)

  1. 25 µl AMPureXPを加え、よく撹拌して、5分間室温で放置する。
  2. 遠心後、磁性スタンドに立て、上清を回収する。
  3. 10 µl AMPureXPを加え、よく撹拌して、5分間室温で放置する。
  4. 遠心して上清を捨てる。
  5. 200 µl 80%エタノールを加え、30秒後、上清を捨てる。スタンドから外して混ぜたりする必要はない。2回行う。
  6. 遠心して上清を捨てたあと、5分間乾燥させる。
  7. 17 µl 0.1 x TEを加え、懸濁する。2分室温で放置する。
  8. 上清 15 µl を回収する。ここで止められる(-20℃)。

[編集] PCR (約1.5時間)

  1. 5 µl Universal PCR primer、5 µl Index primer、25 µl NEBNext Ultra II Q5 Master Mixを加える。全体で50 µlになる。
  2. 98℃で30秒、(98℃で10秒、65℃で75秒) x 6 cycle、65℃で5分、のPCRを行う。
  3. 45 µl KAPA Hyper Pure Beads を加え、を加え、精製する。32.5 µl 0.1 x TEを加え、30 µl 回収する。ここで止められる(-20℃)。
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