NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit
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# 10回ピペッティングで混ぜる。 | # 10回ピペッティングで混ぜる。 | ||
# 20℃で15分間、インキュベートする。 | # 20℃で15分間、インキュベートする。 | ||
| − | # 3 µl USER | + | # 3 µl USER Enzymeを加える(ピペットの目盛りは2.5µl)。10回ピペッティングで混ぜる。 |
# 37℃で15分間、インキュベートする。 | # 37℃で15分間、インキュベートする。 | ||
=== サイズ分画 (約0.5時間) === | === サイズ分画 (約0.5時間) === | ||
| − | # | + | # 25 µl AMPureXPを加え、よく撹拌して、5分間室温で放置する。 |
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# 遠心後、磁性スタンドに立て、上清を'''回収'''する。 | # 遠心後、磁性スタンドに立て、上清を'''回収'''する。 | ||
| − | # | + | # 10 µl AMPureXPを加え、よく撹拌して、5分間室温で放置する。 |
# 遠心して上清を捨てる。 | # 遠心して上清を捨てる。 | ||
| − | # 200 | + | # 200 µl 80%エタノールを加え、30秒後、上清を捨てる。スタンドから外して混ぜたりする必要はない。2回行う。 |
# 遠心して上清を捨てたあと、5分間乾燥させる。 | # 遠心して上清を捨てたあと、5分間乾燥させる。 | ||
| − | # | + | # 17 µl 0.1 x TEを加え、懸濁する。2分室温で放置する。 |
| − | # 上清 | + | # 上清 15 µl を回収する。ここで止められる(-20℃)。 |
=== PCR (約1.5時間) === | === PCR (約1.5時間) === | ||
| − | # 5 | + | # 5 µl Universal PCR primer、5 µl Index primer、25 µl NEBNext Ultra II Q5 Master Mixを加える。全体で50 µlになる。 |
| − | # | + | # 98℃で30秒、(98℃で10秒、65℃で75秒) x 6 cycle、65℃で5分、のPCRを行う。 |
| − | # | + | # 45 µl KAPA Hyper Pure Beads を加え、を加え、精製する。32.5 µl 0.1 x TEを加え、30 µl 回収する。ここで止められる(-20℃)。 |
2024年4月20日 (土) 11:41時点における最新版
目次 |
[編集] DNA断片化 (約1時間)
- DNA 1 µg / 52.5 µl に調整する。
- Covaris S2で断片化する。
- 古田(内線5548に電話する。装置の電源を入れておいてくれる)。
- DNA300bp micro Tube 130µl Holder XTUの設定を使用する。以下の設定は過去の記録で、現在の設定と同じかどうか不明。
| DNAの長さ(目標) | 350bp | 550 bp |
| Duty Cycle | 10% | |
| Intensity | 5 | 2 |
| Cycles per Burst | 200 | |
| Time (duration) | 45 | |
| Mode | Frequency sweeping | |
- DNA溶液 50 µl を回収する。
[編集] DNA精製
- KAPA Hyper Pure Beads を80 µl加える。よく撹拌して、5分間室温で放置する。
- 遠心後、磁性スタンドに立て、上清を捨てる。
- 200 µl 80%エタノールを加え、30秒後、上清を捨てる。スタンドから外して混ぜたりする必要はない。2回行う。
- 遠心して上清を捨てたあと、5分間乾燥させる。
- 53 µl 0.1 x TEを加え、懸濁する。2分室温で放置する。
- 遠心後、磁性スタンドに立て、上清 50 µl を回収する。
[編集] 末端整形 (約1.1時間)
- 7 µl NEBNext UltraII End Prep Reaction Buf.と3 µl Enzyme Mixを加える(Enzyme Mixは粘性が高いのでピペットの目盛りは2µlにする)。10回ピペッティングで混ぜる。
- 20℃で30分間、インキュベートする。
- 65℃で30分間、インキュベートする。
[編集] アダプターのライゲーション (約1時間)
- 2.5 µl アダプター原液を加える。最初のDNAが100ng以下の場合は希釈する(マニュアル参照)。
- 30 µl NEBNext Ultra II Ligation Master Mixを加える。
- 1 µl NEBNext Ligation Enhancerを加える。
- 10回ピペッティングで混ぜる。
- 20℃で15分間、インキュベートする。
- 3 µl USER Enzymeを加える(ピペットの目盛りは2.5µl)。10回ピペッティングで混ぜる。
- 37℃で15分間、インキュベートする。
[編集] サイズ分画 (約0.5時間)
- 25 µl AMPureXPを加え、よく撹拌して、5分間室温で放置する。
- 遠心後、磁性スタンドに立て、上清を回収する。
- 10 µl AMPureXPを加え、よく撹拌して、5分間室温で放置する。
- 遠心して上清を捨てる。
- 200 µl 80%エタノールを加え、30秒後、上清を捨てる。スタンドから外して混ぜたりする必要はない。2回行う。
- 遠心して上清を捨てたあと、5分間乾燥させる。
- 17 µl 0.1 x TEを加え、懸濁する。2分室温で放置する。
- 上清 15 µl を回収する。ここで止められる(-20℃)。
[編集] PCR (約1.5時間)
- 5 µl Universal PCR primer、5 µl Index primer、25 µl NEBNext Ultra II Q5 Master Mixを加える。全体で50 µlになる。
- 98℃で30秒、(98℃で10秒、65℃で75秒) x 6 cycle、65℃で5分、のPCRを行う。
- 45 µl KAPA Hyper Pure Beads を加え、を加え、精製する。32.5 µl 0.1 x TEを加え、30 µl 回収する。ここで止められる(-20℃)。
