NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit
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(ページの作成:「=== ポリA精製 === # 10 ng - 1 µgのRNAを50µlにする # NEBNext Oligo d(T)25 beads 20µl x サンプル数をエッペンに分注する。 # RNA Binding Buffer (2...」) |
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# RNA Binding Buffer (2x) 50 µl x サンプル数を加え、懸濁する。 | # RNA Binding Buffer (2x) 50 µl x サンプル数を加え、懸濁する。 | ||
# 懸濁したビーズ50µlをRNAに加える。 | # 懸濁したビーズ50µlをRNAに加える。 | ||
| − | # | + | # 65℃で5分間保温する。その後氷につけて冷やす。 |
| − | # | + | # ビーズを懸濁しながら室温で5分間保温する。 |
# 遠心後、磁性体スタンドに置き、上清を捨てる。 | # 遠心後、磁性体スタンドに置き、上清を捨てる。 | ||
# Wash Buffer 200µlを加え、懸濁する。スタンドに置いて上清を捨てる。2回行う。 | # Wash Buffer 200µlを加え、懸濁する。スタンドに置いて上清を捨てる。2回行う。 | ||
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# 遠心後、磁性体スタンドに置き、上清を捨てる。 | # 遠心後、磁性体スタンドに置き、上清を捨てる。 | ||
# Wash Buffer 200µlを加え、懸濁する。スタンドに置いて上清を捨てる。 | # Wash Buffer 200µlを加え、懸濁する。スタンドに置いて上清を捨てる。 | ||
| − | # 水 10 µl、NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X) 8 µl、NEBNext Random Primers 2 µlを加える。 | + | # 水 10 µl、NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X) 8 µl、NEBNext Random Primers 2 µlを加える。''試薬はピンクの印'' |
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# 94℃で10分間保温する。氷につけて室温に戻す。 | # 94℃で10分間保温する。氷につけて室温に戻す。 | ||
# 遠心後、磁性体スタンドに置き、上清を新しいチューブに回収する。 | # 遠心後、磁性体スタンドに置き、上清を新しいチューブに回収する。 | ||
=== cDNA合成 === | === cDNA合成 === | ||
| − | # Murine RNase Inhibitor 0.5 µl、ProtoScript II Reverse Transcriptase 1µl、水 3.5 µlを加える。 | + | # Murine RNase Inhibitor 0.5 µl、ProtoScript II Reverse Transcriptase 1µl、水 3.5 µlを加える。''試薬はピンクの印'' |
# 25℃で10分、42℃で15分、70℃で15分保温する。 | # 25℃で10分、42℃で15分、70℃で15分保温する。 | ||
| − | # Second Strand Synthesis Reaction Buffer (10x) 8 µl、Second Strand Synthesis Enzyme Mix 4 µl、水 48 µlを加える。 | + | # Second Strand Synthesis Reaction Buffer (10x) 8 µl、Second Strand Synthesis Enzyme Mix 4 µl、水 48 µlを加える。''試薬はオレンジの印'' |
# 16℃で1時間保温する。 | # 16℃で1時間保温する。 | ||
=== DNA精製 === | === DNA精製 === | ||
# AMPure XP 144 µl (1.8倍量)を加えて、よく撹拌して、5分間室温で放置する。 | # AMPure XP 144 µl (1.8倍量)を加えて、よく撹拌して、5分間室温で放置する。 | ||
| − | # | + | # 遠心後、磁性体スタンドに置き、上清を捨てる。 |
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# 200 µl 80%エタノールを加え、30秒後、上清を捨てる。スタンドから外して混ぜたりする必要はない。2回行う。 | # 200 µl 80%エタノールを加え、30秒後、上清を捨てる。スタンドから外して混ぜたりする必要はない。2回行う。 | ||
# 遠心して上清を捨てたあと、5分間乾燥させる。 | # 遠心して上清を捨てたあと、5分間乾燥させる。 | ||
| − | # 60 µl | + | # 60 µl RSB (TruSeqのキットに付属)を加え、懸濁する。2分室温で放置する。 |
# 上清 55.5 µl を回収する。ここで止められる(-20℃)。 | # 上清 55.5 µl を回収する。ここで止められる(-20℃)。 | ||
=== 末端形成 === | === 末端形成 === | ||
| − | # NEBNext End Repair Reaction Buffer (10x) 6.5 µl、NEBNext End Prep Enzyme Mix 3 µlを加える。 | + | # NEBNext End Repair Reaction Buffer (10x) 6.5 µl、NEBNext End Prep Enzyme Mix 3 µlを加える。''試薬は緑の印'' |
# 20℃で30分間、65℃で30分間、保温する。 | # 20℃で30分間、65℃で30分間、保温する。 | ||
=== アダプター結合 === | === アダプター結合 === | ||
| − | # Blunt/TA Ligase Master Mix 15µl、1.5 µM NEBNext Adaptor 1 µl、水 2.5 µlを加える。 | + | # Blunt/TA Ligase Master Mix 15µl、1.5 µM NEBNext Adaptor 1 µl、水 2.5 µlを加える。''試薬は赤の印'' 購入したNEBNext Adaptorは15µMの濃度なのでRSBで希釈する。 |
# 20℃で15分間保温する。 | # 20℃で15分間保温する。 | ||
# USER Enzyme 3 µlを加える。 | # USER Enzyme 3 µlを加える。 | ||
2017年4月20日 (木) 16:31時点における最新版
目次 |
[編集] ポリA精製
- 10 ng - 1 µgのRNAを50µlにする
- NEBNext Oligo d(T)25 beads 20µl x サンプル数をエッペンに分注する。
- RNA Binding Buffer (2x) 100 µl x サンプル数を加え、ビーズを洗う。遠心して、ビーズを沈殿させ、磁性体スタンドに置く。上清を捨てビーズを回収する。2回行う。
- RNA Binding Buffer (2x) 50 µl x サンプル数を加え、懸濁する。
- 懸濁したビーズ50µlをRNAに加える。
- 65℃で5分間保温する。その後氷につけて冷やす。
- ビーズを懸濁しながら室温で5分間保温する。
- 遠心後、磁性体スタンドに置き、上清を捨てる。
- Wash Buffer 200µlを加え、懸濁する。スタンドに置いて上清を捨てる。2回行う。
- Tris Buffer 50µlを加え、懸濁する。
- 80℃で2分保温する。その後氷につけて冷やす。
- RNA Binding Buffer (2x) 50µlを加え、懸濁する。懸濁しながら室温で10分間温める。
- 遠心後、磁性体スタンドに置き、上清を捨てる。
- Wash Buffer 200µlを加え、懸濁する。スタンドに置いて上清を捨てる。
- 水 10 µl、NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X) 8 µl、NEBNext Random Primers 2 µlを加える。試薬はピンクの印
- 94℃で10分間保温する。氷につけて室温に戻す。
- 遠心後、磁性体スタンドに置き、上清を新しいチューブに回収する。
[編集] cDNA合成
- Murine RNase Inhibitor 0.5 µl、ProtoScript II Reverse Transcriptase 1µl、水 3.5 µlを加える。試薬はピンクの印
- 25℃で10分、42℃で15分、70℃で15分保温する。
- Second Strand Synthesis Reaction Buffer (10x) 8 µl、Second Strand Synthesis Enzyme Mix 4 µl、水 48 µlを加える。試薬はオレンジの印
- 16℃で1時間保温する。
[編集] DNA精製
- AMPure XP 144 µl (1.8倍量)を加えて、よく撹拌して、5分間室温で放置する。
- 遠心後、磁性体スタンドに置き、上清を捨てる。
- 200 µl 80%エタノールを加え、30秒後、上清を捨てる。スタンドから外して混ぜたりする必要はない。2回行う。
- 遠心して上清を捨てたあと、5分間乾燥させる。
- 60 µl RSB (TruSeqのキットに付属)を加え、懸濁する。2分室温で放置する。
- 上清 55.5 µl を回収する。ここで止められる(-20℃)。
[編集] 末端形成
- NEBNext End Repair Reaction Buffer (10x) 6.5 µl、NEBNext End Prep Enzyme Mix 3 µlを加える。試薬は緑の印
- 20℃で30分間、65℃で30分間、保温する。
[編集] アダプター結合
- Blunt/TA Ligase Master Mix 15µl、1.5 µM NEBNext Adaptor 1 µl、水 2.5 µlを加える。試薬は赤の印 購入したNEBNext Adaptorは15µMの濃度なのでRSBで希釈する。
- 20℃で15分間保温する。
- USER Enzyme 3 µlを加える。
- 37℃で15分間保温する。
- AMPure XP 100 µl (等量)を加え、精製する。52 µl RSBを加え、50 µl 回収する。
- AMPure XP 50 µl (等量)を加え、2回目の精製をする。22 µl RSBを加え、20 µl 回収する。ここで止められる(-20℃)。
[編集] PCR (約1.5時間)
- Index Primer 2.5 µl、Universal PCR Primer 2.5 µl 、NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix 25 µlを加える。
- 95℃で3分、(98℃で10秒、65℃で75秒) x 8 cycle、65℃で5分、のPCRを行う。
- AMPure XP 45 µl (0.9倍量)を加え、精製する。23 µl RSBを加え、21 µl 回収する。ここで止められる(-20℃)。
