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! 判定する遺伝子型 !! プライマーの組み合せ !! アニーリング温度 !! 伸長時間 !! バンドの長さ !! 備考 | ! 判定する遺伝子型 !! プライマーの組み合せ !! アニーリング温度 !! 伸長時間 !! バンドの長さ !! 備考 | ||
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| − | | '''drol1-1''' || ・At3g24730#143-F <br>・drol1-1_HindIII || 55℃ || 1 min でOK || (185 bp) || このPCR産物をさらに制限酵素 HindIII で切って判別 | + | | '''drol1-1''' || width="150pt" |・At3g24730#143-F <br>・drol1-1_HindIII || 55℃ || 1 min でOK || (185 bp) || このPCR産物をさらに制限酵素 HindIII で切って判別 <br> (方法は下記参照) |
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| − | | '''drol1-2''' ||「genome,WT」<br>・At3g24730#143-F <br>・anti6_At3724730 <br> 「T-DNA」 <br>・At3g24730#143-F <br>・LBb1.3|| 55℃ || 2 min || XX bp || | + | | '''drol1-2''' ||「genome,WT」<br>・At3g24730#143-F <br>・anti6_At3724730 <br> 「T-DNA」 <br>・At3g24730#143-F <br>・LBb1.3|| 55℃ || 2 min || XX bp || 各個体について、「genome,WT」「T-DNA」の2種類のPCRを行った結果を合わせて判断。 <br>このプライマーでは、プライマー3本（At3g24730#143-F, anti6_At3724730, LBb1.3）を混ぜたPCRでは判別できない |
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! 判定する遺伝子型 !! プライマーの組み合せ !! アニーリング温度 !! 伸長時間 !! バンドの長さ !! 備考 | ! 判定する遺伝子型 !! プライマーの組み合せ !! アニーリング温度 !! 伸長時間 !! バンドの長さ !! 備考 | ||
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| − | | '''drol1-1''' || ・At3g24730#143-F <br>・drol1-1_HindIII || 55℃ || 1 min でOK || (185 bp) || このPCR産物をさらにHindIII処理 | + | | '''drol1-1''' ||・At3g24730#143-F <br>・drol1-1_HindIII || 55℃ || 1 min でOK || (185 bp) || このPCR産物をさらにHindIII処理 |
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| '''drol1-2''' || sense, anti|| 55℃ || 2 min || XX bp || 備考 | | '''drol1-2''' || sense, anti|| 55℃ || 2 min || XX bp || 備考 | ||
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| + | {| class="wikitable mw-collapsible mw-collapsed" data-expandtext="開く" data-collapsetext="閉じる" | ||
| + | !マイ || ヘッダ | ||
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| + | | A || B | ||
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| + | | C || D | ||
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| + | {| class="wikitable mw-collapsible mw-collapsed" data-expandtext="開く" data-collapsetext="閉じる" | ||
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| + | このテキストは折り畳み可能ではありません。しかし次のテキストはデフォルトで折り畳み可能で隠蔽されています: | ||
| + | <div class="mw-collapsible-content">このテキストはデフォルトで隠蔽されているはずです。</div> | ||
| + | 同様にこのテキストは可視化されているはずです。 | ||
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| + | <td>1</td> | ||
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| + | <!-- tr：行、td:セル、th:ヘッダ --> | ||
| + | |||
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| + | <table> | ||
| + | <tr> | ||
| + | <td> | ||
| + | {| class="wikitable" | ||
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| + | |>U540k<BR>ATGGAAATCATGTCAAGAGAGAA.....<BR> | ||
| + | >sgRNA3+PAM<BR>TGACAGAACCGGTATGGCCT'''GGG'''<BR> | ||
| + | |- | ||
| + | |} | ||
| + | </td> | ||
| + | <td> | ||
| + | * （1行目）“>遺伝子名” を記入<BR> | ||
| + | **（2行目）標的遺伝子のゲノムDNAの配列 を記入<BR> | ||
| + | （3行目）“>sgRNA名など” を記入<BR> | ||
| + | （4行目）sgRNAの配列（'''PAM'''含めて）を記入<BR> | ||
| + | |||
| + | </td> | ||
| + | </tr> | ||
| + | </table> | ||
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| + | :{| class="wikitable mw-collapsible mw-collapsed" data-expandtext="開く" data-collapsetext="閉じる" | ||
| + | !アグロバクテリウムの感染後、シークエンス解析に至るまでの流れ （概要説明） | ||
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| + | |1) 形質転換されたT1植物を選抜し、生育する | ||
| + | :* pKIベクターを用いた場合、T1種子の中から「OLE-tagRFPが光る」ものを播いて育てる （＝T-DNAが組み込まれている） | ||
| + | |- | ||
| + | |2) 目的の遺伝子がゲノム編集されている個体を選抜・生育し、T2種子をとる<BR> | ||
| + | :* genotyping：PCR＋制限酵素処理で、変異遺伝子を持つ個体を選抜 （制限酵素処理で、切れる：野生型（WT型）、切れない：変異型） | ||
| + | |- | ||
| + | |3) T2世代で、Cas9を持たない植物を選抜する | ||
| + | :* pKIベクターを用いた場合、T2種子の中から「OLE-tagRFPが光らない」ものを播いて育てる （＝T-DNA、Cas9を持たない） | ||
| + | |- | ||
| + | |4) T2世代で、目的の遺伝子がゲノム編集されている個体を選抜する | ||
| + | :* 2) と同様のgenotypingを実施 | ||
| + | |- | ||
| + | |5) キャピラリーシークエンサーでの解析 | ||
| + | :* 4) のgenotypingの時のPCR産物（制限酵素処理する前のもの）を、キャピラリーシークエンサーで解析する | ||
| + | ::* PCRに用いた両端のプライマー各々で解析したファイルを作成。このファイルを用いて以降の解析を行う | ||
| + | |- | ||
|} | |} | ||
2021年11月11日 (木) 16:51時点における最新版
| 判定する遺伝子型 | プライマーの組み合せ | アニーリング温度 | 伸長時間 | バンドの長さ | 備考 |
|---|---|---|---|---|---|
| drol1-1 | ・At3g24730#143-F ・drol1-1_HindIII |
55℃ | 1 min でOK | (185 bp) | このPCR産物をさらに制限酵素 HindIII で切って判別 (方法は下記参照) |
| drol1-2 | 「genome,WT」 ・At3g24730#143-F ・anti6_At3724730 「T-DNA」 ・At3g24730#143-F ・LBb1.3 |
55℃ | 2 min | XX bp | 各個体について、「genome,WT」「T-DNA」の2種類のPCRを行った結果を合わせて判断。 このプライマーでは、プライマー3本（At3g24730#143-F, anti6_At3724730, LBb1.3）を混ぜたPCRでは判別できない |
| 判定する遺伝子型 | プライマーの組み合せ | アニーリング温度 | 伸長時間 | バンドの長さ | 備考 |
|---|---|---|---|---|---|
| drol1-1 | ・At3g24730#143-F ・drol1-1_HindIII |
55℃ | 1 min でOK | (185 bp) | このPCR産物をさらにHindIII処理 |
| drol1-2 | sense, anti | 55℃ | 2 min | XX bp | 備考 |
| 列1 | 列2 | 列3 |
|---|---|---|
| A | B | |
| C | D | |
| E | F | F F2 |
| G | H | |
| H | ||
| 列1 | 列2 | 列3 |
|---|---|---|
| A | B | |
| C | D | |
| E | F | F |
| G | H | |
| H | ||
| 列1 | 列2 | 列3 |
|---|---|---|
| A | B | |
| C | D | |
| E | F | |
| G | ||
| H | ||
| マイ | ヘッダ |
|---|---|
| A | B |
| C | D |
| マイ |
|---|
| A |
| C |
このテキストは折り畳み可能ではありません。しかし次のテキストはデフォルトで折り畳み可能で隠蔽されています:
このテキストはデフォルトで隠蔽されているはずです。
同様にこのテキストは可視化されているはずです。
| 1 | 2 |
| 3 | 4 |
|
（3行目）“>sgRNA名など” を記入 |
アグロバクテリウムの感染後、シークエンス解析に至るまでの流れ （概要説明） 1) 形質転換されたT1植物を選抜し、生育する - pKIベクターを用いた場合、T1種子の中から「OLE-tagRFPが光る」ものを播いて育てる （＝T-DNAが組み込まれている）
2) 目的の遺伝子がゲノム編集されている個体を選抜・生育し、T2種子をとる
- genotyping：PCR＋制限酵素処理で、変異遺伝子を持つ個体を選抜 （制限酵素処理で、切れる：野生型（WT型）、切れない：変異型）
3) T2世代で、Cas9を持たない植物を選抜する - pKIベクターを用いた場合、T2種子の中から「OLE-tagRFPが光らない」ものを播いて育てる （＝T-DNA、Cas9を持たない）
4) T2世代で、目的の遺伝子がゲノム編集されている個体を選抜する - 2) と同様のgenotypingを実施
5) キャピラリーシークエンサーでの解析 - 4) のgenotypingの時のPCR産物（制限酵素処理する前のもの）を、キャピラリーシークエンサーで解析する
- PCRに用いた両端のプライマー各々で解析したファイルを作成。このファイルを用いて以降の解析を行う
