ゲノム編集した植物のシークエンスの解析
提供: 鈴木研Wiki
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2021年11月4日 (木) 10:28時点における版
（注意：編集中！）
CRISPR-Cas9でゲノム編集した植物のシークエンスを解析し、変異を同定する方法。
T2世代で変異アリルをもつものを選抜する （Cas9を持たないものを選抜。pKIベクターを用いた場合、OLE-RFPが光らない種子） （genotyping：PCR＋制限酵素処理で、切れないバンドを持つ個体を選抜） 上記のPCR産物を、PCRに用いたプライマー各々でキャピラリーシークエンスを行う。 この時に、シークエンスを解析し、変異を同定する方法。
1) 解析に使うファイルを準備する
- キャピラリーシークエンサーで読んだ波形ファイル（拡張子.ab1）
- ゲノム編集した箇所をはさんだ領域をPCRで増幅したものを、両側のプライマーでシークエンス解析したファイル
- ゲノム編集した遺伝子のもとの配列とsgRNAの配列。FASTA形式で保存する
- 「メモ帳」等のテキストエディタを起動し、以下の内容を記述したファイルを作成する（ファイル保存時に、拡張子を「.txt」から「.fasta」に変更）
>遺伝子名
ATGCCGGAATAG.....
>sgRNA+PAM
xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxNGG
2) シーケンスアセンブリソフトウェア「ATGC」を起動
- 「ATGC」は共通PCにインストールしてあります
自分のPCで解析したい場合 インストール方法：中部大学総合情報センターから「Genetyx」をダウンロード・インストールして使用する
http://www.isc.chubu.ac.jp/services/chubu/genetyx.html
- 上記ページへのアクセス、および「Genetyx」のダウンロード・インストールは中部大学内のネットワークへの接続が必要
起動方法：「ATGC」は遺伝情報処理ソフトウェア「Genetyx」内にあるので、以下のいずれかの方法で起動する - (A) 「Genetyx」を起動し、ツールバーの「起動」-「ATGC」を選択
- (B) 各自のPCの「C:ドライブ」-「Program Files」-「Genetyx_VerXX_Net」フォルダ内の「ATGC.exe」を起動
- (A)の方法で起動する場合は、PCが中部大学内のネットワークに接続されている必要がある
初期設定：「ATGC」は初回使用時にパラメータを設定する必要がある（共通PCは設定済み） - 「ファイル」-「環境設定」-「解析」を選択し
- 最小ホモロジースコア「30」
- 最小一致塩基数「10」
に変更する
3)・キャピラリーシークエンスのファイル（拡張子.ab1のファイル） ・
