NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit
提供: 鈴木研Wiki
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# DNA 1 µg / 52.5 µl に調整する。 | # DNA 1 µg / 52.5 µl に調整する。 | ||
# Covaris S2で断片化する。 | # Covaris S2で断片化する。 | ||
| − | + | * 古田(内線5548に電話する。装置の電源を入れておいてくれる)。 | |
| − | + | * DNA300bp micro Tube 130µl Holder XTUの設定を使用する。以下の設定は過去の記録で、現在の設定と同じかどうか不明。 | |
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|+ Covarisの設定 | |+ Covarisの設定 | ||
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=== アダプターのライゲーション (約1時間) === | === アダプターのライゲーション (約1時間) === | ||
| − | # 2.5 µl | + | # 2.5 µl アダプター原液を加える。最初のDNAが100ng以下の場合は希釈する(マニュアル参照)。 |
| − | # | + | # 30 µl NEBNext Ultra II Ligation Master Mixを加える。 |
| + | # 1 µl NEBNext Ligation Enhancerを加える。 | ||
# 10回ピペッティングで混ぜる。 | # 10回ピペッティングで混ぜる。 | ||
| − | # | + | # 20℃で15分間、インキュベートする。 |
| − | # | + | # 3 µl USER Enzymeを加える。10回ピペッティングで混ぜる。 |
| − | # | + | # 37℃で15分間、インキュベートする。 |
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=== サイズ分画 (約0.5時間) === | === サイズ分画 (約0.5時間) === | ||
2024年4月20日 (土) 11:28時点における版
目次 |
DNA断片化 (約1時間)
- DNA 1 µg / 52.5 µl に調整する。
- Covaris S2で断片化する。
- 古田(内線5548に電話する。装置の電源を入れておいてくれる)。
- DNA300bp micro Tube 130µl Holder XTUの設定を使用する。以下の設定は過去の記録で、現在の設定と同じかどうか不明。
| DNAの長さ(目標) | 350bp | 550 bp |
| Duty Cycle | 10% | |
| Intensity | 5 | 2 |
| Cycles per Burst | 200 | |
| Time (duration) | 45 | |
| Mode | Frequency sweeping | |
- DNA溶液 50 µl を回収する。
DNA精製
- KAPA Hyper Pure Beads を80 µl加える。よく撹拌して、5分間室温で放置する。
- 遠心後、磁性スタンドに立て、上清を捨てる。
- 200 µl 80%エタノールを加え、30秒後、上清を捨てる。スタンドから外して混ぜたりする必要はない。2回行う。
- 遠心して上清を捨てたあと、5分間乾燥させる。
- 53 µl 0.1 x TEを加え、懸濁する。2分室温で放置する。
- 遠心後、磁性スタンドに立て、上清 50 µl を回収する。
末端整形 (約1.1時間)
- 7 µl NEBNext UltraII End Prep Reaction Buf.と3 µl Enzyme Mixを加える(Enzyme Mixは粘性が高いのでピペットの目盛りは2µlにする)。10回ピペッティングで混ぜる。
- 20℃で30分間、インキュベートする。
- 65℃で30分間、インキュベートする。
アダプターのライゲーション (約1時間)
- 2.5 µl アダプター原液を加える。最初のDNAが100ng以下の場合は希釈する(マニュアル参照)。
- 30 µl NEBNext Ultra II Ligation Master Mixを加える。
- 1 µl NEBNext Ligation Enhancerを加える。
- 10回ピペッティングで混ぜる。
- 20℃で15分間、インキュベートする。
- 3 µl USER Enzymeを加える。10回ピペッティングで混ぜる。
- 37℃で15分間、インキュベートする。
サイズ分画 (約0.5時間)
- Sample Purification Beadsと水を以下のように混ぜる。
- DNAの長さ350bpのとき、Sample Purification Beads 60 µl、水 40 µl
- DNAの長さ550bpのとき、Sample Purification Beads 50 µl、水 50 µl
- 希釈したSample Purification Beads 80 µl(標準プロトコール160µlの半分)を加え、よく撹拌して、5分間室温で放置する。
- 遠心後、磁性スタンドに立て、上清を回収する。
- Sample Purification Beads 15 µl(標準プロトコール30µlの半分)を加え、よく撹拌して、5分間室温で放置する。
- 遠心して上清を捨てる。
- 200 µl 80%エタノールを加え、30秒後、上清を捨てる。スタンドから外して混ぜたりする必要はない。2回行う。
- 遠心して上清を捨てたあと、5分間乾燥させる。
- 20 µl Resuspension Bufferを加え、懸濁する。2分室温で放置する。
- 上清 17.5 µl を回収する。ここで止められる(-20℃)。
PCR (約1.5時間)
- 5 µl PCR Primer Cocktailを加える。25 µl PCR Master Mixを加える。初めて使用するときはPCR Master Mixを200 µlずつ小分けする。
- 95℃で3分、(98℃で20秒、60℃で15秒、72℃で30秒) x 8 cycle、72℃で5分、のPCRを行う。
- Sample Purification Beads (50 µl)を加え、精製する。32.5 µl RSBを加え、30 µl 回収する。ここで止められる(-20℃)。
