インバースPCR
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# -20℃で保存する。 | # -20℃で保存する。 | ||
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== 試薬 == | == 試薬 == | ||
* DNA Ligation Kit | * DNA Ligation Kit | ||
| + | * DH5α | ||
| + | * SOC | ||
| + | * 適当な抗生物質入りの培地 | ||
== 作成手順 == | == 作成手順 == | ||
# インバースPCRをした産物 2μlと、DNA Ligation Kit 2μlを混合する。 | # インバースPCRをした産物 2μlと、DNA Ligation Kit 2μlを混合する。 | ||
# 16℃で 30分保温する。 | # 16℃で 30分保温する。 | ||
2019年12月3日 (火) 20:32時点における版
目次 |
プライマーのリン酸化
試薬
- リン酸化するプライマーS(50μM)
- T4 PNK(Poly Nucleotide Kinase)
- T4 DNA Ligase Buffer
作成手順
- リン酸化するプライマー(S)を 2μl、T4 PNKを 1μl、T4 DNA Ligase Bufferを 2μl加え、H2Oで全量を20μlにする。
- それを 37℃で30分保温する。
- 次に 65℃で20分保温する。
- 最後に H2Oを 80μl加え、全量を 100μlにして、リン酸化済み 1μMのプライマーを作成する。
- -20℃で保存する。
インバースPCR
試薬
- KOD Plus
- KOD Buffer
- 2mM dNTP
- 25mM MgSO4
- リン酸化済みプライマーS(1μM)
- リン酸化していないプライマーA(1μM)
PCR
- 1000希釈した鋳型DNAを 1μl、KOD Plusを 1μl、KOD Bufferを 5μl、2mM dNTPを 5μl、25mM MgSO4を 5μl、リン酸化済みプライマー(S)を 15μl、プライマー(A)を 15μl混合し、H2Oで全量を 50μlにする。
- PCRをする。(鋳型が pDONR201-HD2Cgの場合、((94℃ 2分)-(94℃ 15秒,58℃ 30秒,68℃ 4分)×25サイクル-(68℃ 7分))で実行する。)
- -20℃で保存する。
セルフライゲーションとDH5αを用いたプラスミド複製
試薬
- DNA Ligation Kit
- DH5α
- SOC
- 適当な抗生物質入りの培地
作成手順
- インバースPCRをした産物 2μlと、DNA Ligation Kit 2μlを混合する。
- 16℃で 30分保温する。
