2019年12月3日 (火) 20:37時点における版

プライマーのリン酸化

試薬

• リン酸化するプライマーS(50μM)
• T4 PNK(Poly Nucleotide Kinase)
• T4 DNA Ligase Buffer

作成手順

1. リン酸化するプライマー(S)を 2μl、T4 PNKを 1μl、T4 DNA Ligase Bufferを 2μl加え、H2Oで全量を20μlにする。
2. それを 37℃で30分保温する。
3. 次に 65℃で20分保温する。
4. 最後に H2Oを 80μl加え、全量を 100μlにして、リン酸化済み 1μMのプライマーを作成する。
5. -20℃で保存する。

インバースPCR

試薬

• KOD Plus
• KOD Buffer
• 2mM dNTP
• 25mM MgSO4
• リン酸化済みプライマーS(1μM)
• リン酸化していないプライマーA(1μM)

PCR

1. 1000希釈した鋳型DNAを 1μl、KOD Plusを 1μl、KOD Bufferを 5μl、2mM dNTPを 5μl、25mM MgSO4を 5μl、リン酸化済みプライマー(S)を 15μl、プライマー(A)を 15μl混合し、H2Oで全量を 50μlにする。
2. PCRをする。(鋳型が pDONR201-HD2Cgの場合、((94℃ 2分)-(94℃ 15秒,58℃ 30秒,68℃ 4分)×25サイクル-(68℃ 7分))で実行する。)
3. -20℃で保存する。

セルフライゲーションとDH5αを用いたプラスミド複製

試薬

• DNA Ligation Kit
• DH5α
• SOC
• 適当な抗生物質入りの培地

作成手順

1. インバースPCRをした産物 2μlと、DNA Ligation Kit 2μlを混合する。
2. 16℃で 30分保温しセルフライゲーションをする。
3. DH5αを氷上で解凍する。
4. セルフライゲーションした産物にDH5αを 50μl加えて 30分氷上で保温する。
5. 42℃で 45秒保温しすぐ氷上に戻す。
6. SOCを 1ml加え、37℃で 1h培養する。
7. 抗生物質入りの培地にプレーティングして、37℃ 1日暗所で培養する。