TAクローニング

2020年2月20日 (木) 10:13時点における版

使用するキット

• 「TArget Clone -Plus-」 (Toyobo) 　＠フリーザー（-20℃）

実験方法

(1) PCR産物の調製

• 精製したPCR産物を用いる場合、以下の要領で調製する。 (計 9 µl)

	添加量	終濃度
精製PCR産物	5 µl	-
dH2O	1.66 µl	-
KOD -Plus- 10x Buffer	0.9 µl	1x (10倍希釈)
25mM MgSO4	0.54 µl	1.5mM (16.6倍希釈)
2mM dNTPs	0.9 µl	0.2mM (10倍希釈)

(2) 3'末端のdA付加反応

1. (1)で調製したPCR産物（9 µl）に「10x A-attachment Mix」1 µl を添加してよく混ぜる。

2. 60℃で10分間反応させる。

3. 次のライゲーションの直前まで、氷上（あるいは、4℃）に置く

• dA付加反応後は、すぐに次のライゲーションを行う　（この反応で形成した3'突出末端は不安定なため、ライゲーション前で放置しない）

(3) ライゲーション

1. 以下の要領で、ライゲーション反応液を調製する。（計10µl）

	添加量	備考
2x Ligation Buffer	5 µl	-20℃から出して溶解したら、すぐに氷上に置くこと
pTA2 vector (50ng/µl, 3kb)	1 µl	-20℃から出して溶解したら、すぐに氷上に置くこと
(2)でdA付加したPCR産物	3 µl	(モル換算で)vectorの3倍以上の量になるとよい
T4 DNA Ligase	1 µl	氷上に置く（orクーラーボックスを使う）

2. 16℃で30分以上反応させる。

(4) 大腸菌DH5αの形質転換

あとは、ライゲーション産物を用いて大腸菌DH5αのコンピテントセルを形質転換する

• 選抜用の抗生物質は、アンピシリン（50mg/l）を使う
• インサートの有無をチェックできるように、大腸菌をプレートに撒く前に、X-Gal (2%)、IPTG (0.1M)をプレート1枚につき20μlずつ塗布する

• インサートが入ったコロニーは白色、インサートが入らなかったコロニーは青色になる（青白判定）