遺伝子型判定時のマーカーの一覧

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|PCR産物（上記参照）||style="text-align:right;"|3 µl
 
|PCR産物（上記参照）||style="text-align:right;"|3 µl

2023年8月4日 (金) 12:49時点における版

試薬

  • 0.4M NaOH
  • 0.1M Tris-HCl pH 6.8

DNA抽出 　マルチビーズショッカー

  1. 葉を一枚切り取り、サンプル破砕用チューブに入れる
  2. ビーズを一粒入れる
  3. 40 µlの0.4M NaOHを入れる
  4. 2000rpmで5秒オン、2秒オフのサイクルを2回行う
  5. 遠心(フラッシュ)
  6. 200 µlの0.1M Tris-HClを加える
  7. よく混合し、遠心(フラッシュ)
  8. 上清を鋳型として用いる


PCR

MightyAmp Ver.3 の場合

反応液の組成
試薬 1サンプル分の量 備考
MightyAmp Ver3 0.4 µl
2×MightyAmp buffer Ver3 10 µl
プライマー (Forward) 終濃度0.3 µM 10µMの場合、0.6 µl
プライマー (Reverse) 終濃度0.3 µM 10µMの場合、0.6 µl
DNA 1 µl
滅菌水 up to 20 µl
合計 20 µl

反応

  • 2step PCR
  1. 98℃ 2分
  2. [98℃ 10秒、(アニーリング + 伸長反応)68℃ 1分] のサイクルを35回


  • 3step PCR
  1. 98℃ 2分
  2. [98℃ 10秒、(アニーリング)60℃ 15秒、(伸長反応)68℃ 1分] のサイクルを35回

Ex Taq の場合

反応液の組成
試薬 1サンプル分の量 備考
ExTaq 0.1 µl
10×ExTaq Buffer 2 µl
2.5mM dNTP 1.6 µl
プライマー (Forward) 終濃度 0.2 µM 10µMの場合、0.4 µl
プライマー (Reverse) 終濃度 0.2 µM 10µMの場合、0.4 µl
DNA 1 µl
滅菌水 up to 20 µl
合計 20 µl

反応

  1. 95℃ 3分
  2. [95℃ 45秒、(アニーリング)55℃ 45秒、(伸長反応)72℃ 2分] のサイクルを35回
  3. 72℃ 5分 (→ 4℃ ∞)


制限酵素処理

反応液の組成
1サンプル
滅菌水 5.7 µl
10x Buffer 1 µl
制限酵素 0.3 µl
PCR産物（上記参照） 3 µl
合計 10 µl

反応
→　37℃で1～2時間反応

解析

MultiNA（あるいは、アガロースゲル）で電気泳動し、バンドの長さを判別


各drol1変異体の変異箇所とプライマーの結合部位

Drol1 genotyping.png

  • WT (DROL1)
    • PCR：プライマー(1)+(2)で増幅（185bp）
    • HindIII処理後（185bpのまま）
  • drol1-1
    • PCRプライマー：(1)+(2)で増幅（185bp）
    • HindIII処理後（152+33bp）
  • drol1-2
    • PCRプライマー：(1)+(3)で増幅（≒355bp）
    • HindIII処理後（≒355bpのまま）

drol1変異体と各sudl変異体の遺伝子マーカー

プライマーと制限酵素の組合せ

変異体 遺伝子名 PCRのプライマー プライマー配列 PCR断片長 制限酵素 制限酵素処理後の長さ
drol1-1
DROL1 At3g24730#143-F
drol1-1_dCAPS-HindIII		 TGATATCACGTTGTTTCCTTCG
GAAATGCACCAACCCATTTAGTATGATCCGAAGCT		 185 bp HindIII (WT) 185 bp
(drol1-1) 152+33 bp
drol1-2
DROL1 At3g24730#143-F
drol1-1_dCAPS-HindIII
LBb1.3 		TGATATCACGTTGTTTCCTTCG
GAAATGCACCAACCCATTTAGTATGATCCGAAGCT
ATTTTGCCGATTTCGGAAC 		(WT)185 bp
(drol1-2)≒355 bp		 - -
sudl1-1
#8-5 		U5-40k m2g181F
m2g181R		 CAAGATACAATCACAGGTATGAGC
CACAGCTTTGAAATTCAGATCTCTC		 383 bp HaeIII (WT) 272+111 bp
(#8-5) 383 bp
sudl2-1
#47-1a 		PRP6 prp6_47-1aF
prp6_47-1aR		 GCTGAGGAGAAAAGGTACGATGAGA
CCTCTGATCAATAGACTCCCAGATGGCATCAAGCT		 135 bp HindIII (WT) 135 bp
(#47-1a) 102+33 bp
sudl3-1
#14-4 		PRP8 prp8_14-4F
prp8_14-4R		 CAACCCGCAGAAAAGCTACTGCAGTCCTCTCGATC
AGTGACTCTTTTGCATCTTGCTTG		 161 bp PvuI (WT) 128+33 bp
(#14-4) 161 bp
sudl3-2
#49-4a 		PRP8 prp8_49-4aF
prp8_49-4aR		 ATTCATACTTTATTAATTATAGACATTGAGCCACG
ATTCTTGGCGGACACATAGTCTGCAATATTGAGCT		 130 bp SacI (WT) 97+33 bp
(#49-4a) 130 bp
sudl3-3
#51-2a 		PRP8 prp8_51-2aF
prp8_51-2aR		 ACCTGAAAGATGGTCCGTATGTCACTCCAGACTAA
CTTTGTGTCATGTTTGTATGACAATGGAGGGAATG		 131 bp DdeI (WT) 97+34 bp
(#51-2a) 131 bp
sudl4-1
#40-2b 		SmBb smbb_40-2bF
smbb_40-2bR		 GCTTCAGTTCATCAACTACAGG
CTTCTTCCCTTTAGCTGGTGGTAGCTTACGAAGCT		 148 bp HindIII (WT) 148 bp
(#40-2b) 113+35 bp
sudl4-2
#43-2b 		SmBb smbb_43-2bF
smbb_43-2bR		 TCGTGCTAAAGCTGGCTCTGCAGCTGCTGTTGCGG
TCCACCAACACCACGAACAGGAC		 133 bp BamHI (WT) 133 bp
(#43-2b) 97+36 bp
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