遺伝子型判定時のマーカーの一覧

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== (1) DNA抽出 (マルチビーズショッカー) ==
 
==== 試薬 ====
 
* 0.4M NaOH
 
* 0.1M Tris-HCl pH 6.8
 
 
==== 手順 ====
 
# 葉を一枚切り取り、サンプル破砕用チューブに入れる
 
# ビーズを一粒入れる
 
# 40 µlの0.4M NaOHを入れる
 
# 2000rpmで5秒オン、2秒オフのサイクルを2回行う
 
# 遠心(フラッシュ)
 
# 200 µlの0.1M Tris-HClを加える
 
# よく混合し、遠心(フラッシュ)
 
# 上清を鋳型として用いる
 
 
== (2) PCR ==
 
<table border="0"><tr>
 
 
<td>
 
==== MightyAmp Ver.3 の場合 ====
 
{| class='wikitable'
 
|+ '''反応液の組成'''
 
! 試薬 !! 1サンプル分の量 !! 備考
 
|-
 
|MightyAmp Ver3||style="text-align:right;"| 0.4 µl ||
 
|-
 
|2×MightyAmp buffer Ver3 ||style="text-align:right;"| 10 µl ||
 
|-
 
|プライマー (Forward)||style="text-align:right;"| 終濃度0.3 µM || 10µMの場合、0.6 µl
 
|-
 
|プライマー (Reverse)||style="text-align:right;"| 終濃度0.3 µM || 10µMの場合、0.6 µl
 
|-
 
|DNA||style="text-align:right;"| 1 µl ||
 
|-
 
|滅菌水||style="text-align:right;"| up to 20 µl ||
 
|-
 
|合計||style="text-align:right;"| 20 µl ||
 
|}
 
 
'''反応'''
 
* '''2step PCR'''
 
#  98℃ 2分
 
# [98℃ 10秒、(アニーリング + 伸長反応)68℃ 1分] のサイクルを35回
 
# (→ 4℃ ∞)
 
 
 
* '''3step PCR'''
 
#  98℃ 2分
 
# [98℃ 10秒、(アニーリング)60℃ 15秒、(伸長反応)68℃ 1分] のサイクルを35回
 
# (→ 4℃ ∞)
 
 
</td>
 
 
<td>
 
 
==== Ex Taq の場合 ====
 
{| class='wikitable'
 
|+ '''反応液の組成'''
 
! 試薬 !! 1サンプル分の量 !! 備考
 
|-
 
|ExTaq||style="text-align:right;"| 0.1 µl ||
 
|-
 
|10×ExTaq Buffer||style="text-align:right;"| 2 µl ||
 
|-
 
|2.5mM dNTP||style="text-align:right;"| 1.6 µl ||
 
|-
 
|プライマー (Forward)||style="text-align:right;"| 終濃度 0.2 µM || 10µMの場合、0.4 µl
 
|-
 
|プライマー (Reverse)||style="text-align:right;"| 終濃度 0.2 µM || 10µMの場合、0.4 µl
 
|-
 
|DNA||style="text-align:right;"| 1 µl ||
 
|-
 
|滅菌水||style="text-align:right;"| up to 20 µl ||
 
|-
 
|合計||style="text-align:right;"| 20 µl ||
 
|}
 
 
'''反応'''
 
#  95℃ 3分
 
# [95℃ 45秒、(アニーリング)55℃ 45秒、(伸長反応)72℃ 2分] のサイクルを35回
 
#  72℃ 5分  (→ 4℃ ∞)
 
 
<br><br><br>
 
<!-- <table>タグで2段組にすると上下中央揃いになるため、改行タグ<br>で位置合わせした -->
 
</td>
 
 
</tr>
 
</table>
 
 
== (3) 制限酵素処理 ==
 
<table border="0">
 
<tr>
 
 
<td>
 
{| class='wikitable'
 
|+ '''反応液の組成'''
 
|||1サンプル
 
|-
 
|滅菌水||style="text-align:right;"| 5.7 µl
 
|-
 
|10x Buffer||style="text-align:right;"|1 µl
 
|-
 
|制限酵素||style="text-align:right;"|0.3 µl
 
|-
 
|PCR産物(上記参照)||style="text-align:right;"|3 µl
 
|-
 
|合計||style="text-align:right;"|10 µl
 
|}
 
</td>
 
 
<td>
 
'''反応'''
 
<br> → 37℃で1~2時間反応
 
</td>
 
 
</tr>
 
</table>
 
 
== (4) 解析 ==
 
MultiNA(あるいは、アガロースゲル)で電気泳動し、バンドの長さを判別
 
 
 
== < 各drol1変異体の変異箇所とプライマーの結合部位 > ==
 
<table border="0">
 
<tr>
 
 
<td>
 
[[ファイル:drol1_genotyping.png]]
 
</td>
 
 
<td>
 
*'''WT (DROL1)'''
 
**PCR:プライマー(1)+(2)で増幅(185bp)
 
**HindIII処理後(185bpのまま)
 
 
*'''drol1-1'''
 
**PCRプライマー:(1)+(2)で増幅(185bp)
 
**HindIII処理後(152+33bp)
 
 
*'''drol1-2'''
 
**PCRプライマー:(1)+(3)で増幅(≒355bp)
 
**HindIII処理後(≒355bpのまま)
 
</td>
 
 
</tr>
 
</table>
 
 
== < drol1変異体と各sudl変異体の遺伝子マーカー > ==
 
==== プライマーと制限酵素の組合せ ====
 
{| class="wikitable" style="width:100%"
 
! 変異体 !! 遺伝子名 !! PCRのプライマー !! プライマー配列 !! PCR断片長 !! 制限酵素 !! 制限酵素処理後の長さ
 
|-
 
! drol1-1 <br>
 
| DROL1|| At3g24730#143-F <br> drol1-1_dCAPS-HindIII|| TGATATCACGTTGTTTCCTTCG <br> GAAATGCACCAACCCATTTAGTATGATCCGAAGCT|| 185 bp|| HindIII|| (WT) 185 bp <br> (drol1-1) 152+33 bp
 
|-
 
! drol1-2 <br>
 
| DROL1|| At3g24730#143-F <br> drol1-1_dCAPS-HindIII <br> LBb1.3 || TGATATCACGTTGTTTCCTTCG <br> GAAATGCACCAACCCATTTAGTATGATCCGAAGCT <br> ATTTTGCCGATTTCGGAAC || (WT)185 bp <br> (drol1-2)≒355 bp|| - || -
 
|-
 
! sudl1-1 <br> #8-5
 
| U5-40k|| m2g181F <br> m2g181R|| CAAGATACAATCACAGGTATGAGC <br> CACAGCTTTGAAATTCAGATCTCTC|| 383 bp|| HaeIII|| (WT) 272+111 bp <br> (#8-5) 383 bp
 
|-
 
! sudl2-1 <br> #47-1a
 
| PRP6|| prp6_47-1aF <br> prp6_47-1aR|| GCTGAGGAGAAAAGGTACGATGAGA <br> CCTCTGATCAATAGACTCCCAGATGGCATCAAGCT|| 135 bp|| HindIII|| (WT) 135 bp <br> (#47-1a) 102+33 bp
 
|-
 
! sudl3-1 <br> #14-4
 
| PRP8|| prp8_14-4F <br> prp8_14-4R|| CAACCCGCAGAAAAGCTACTGCAGTCCTCTCGATC <br> AGTGACTCTTTTGCATCTTGCTTG|| 161 bp|| PvuI|| (WT) 128+33 bp <br> (#14-4) 161 bp
 
|-
 
! sudl3-2 <br> #49-4a
 
| PRP8|| prp8_49-4aF <br> prp8_49-4aR|| ATTCATACTTTATTAATTATAGACATTGAGCCACG <br> ATTCTTGGCGGACACATAGTCTGCAATATTGAGCT|| 130 bp|| SacI|| (WT) 97+33 bp <br> (#49-4a) 130 bp
 
|-
 
! sudl3-3 <br> #51-2a
 
| PRP8|| prp8_51-2aF <br> prp8_51-2aR|| ACCTGAAAGATGGTCCGTATGTCACTCCAGACTAA <br> CTTTGTGTCATGTTTGTATGACAATGGAGGGAATG|| 131 bp|| DdeI|| (WT) 97+34 bp <br> (#51-2a) 131 bp
 
|-
 
! sudl4-1 <br> #40-2b
 
| SmBb|| smbb_40-2bF <br> smbb_40-2bR|| GCTTCAGTTCATCAACTACAGG <br> CTTCTTCCCTTTAGCTGGTGGTAGCTTACGAAGCT|| 148 bp|| HindIII|| (WT) 148 bp <br> (#40-2b) 113+35 bp
 
|-
 
! sudl4-2 <br> #43-2b
 
| SmBb|| smbb_43-2bF <br> smbb_43-2bR|| TCGTGCTAAAGCTGGCTCTGCAGCTGCTGTTGCGG <br> TCCACCAACACCACGAACAGGAC|| 133 bp|| BamHI|| (WT) 133 bp <br> (#43-2b) 97+36 bp
 
|-
 
|}
 

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