NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit
提供: 鈴木研Wiki
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=== 末端形成 === | === 末端形成 === | ||
# NEBNext Ultra II End Prep Reaction Buffer (10x) 7 µl、NEBNext Ultra II End Prep Enzyme Mix 3 µlを加える。''試薬は緑の印'' | # NEBNext Ultra II End Prep Reaction Buffer (10x) 7 µl、NEBNext Ultra II End Prep Enzyme Mix 3 µlを加える。''試薬は緑の印'' | ||
| + | ## * 補足：End Prep Enzyme Mix はキットの中で減りが速い、粘性が高いため、ピペットの目盛りを2 µlに合わせて吸う（と3 µl相当分が取れる） | ||
# 20℃で30分間、65℃で30分間、保温する。 | # 20℃で30分間、65℃で30分間、保温する。 | ||
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# 20℃で15分間保温する。 | # 20℃で15分間保温する。 | ||
# USER Enzyme 3 µlを加える。 | # USER Enzyme 3 µlを加える。 | ||
| + | ## * 補足：End Prep Enzyme Mix 同様に粘性が高いため、ピペットの目盛りを2.5 µlに合わせて吸う | ||
# 37℃で15分間保温する。 | # 37℃で15分間保温する。 | ||
# AMPure XP 100 µl (等量)を加え、精製する。16 µl RSBを加え、15 µl 回収する。 | # AMPure XP 100 µl (等量)を加え、精製する。16 µl RSBを加え、15 µl 回収する。 | ||
| + | ## * 訂正：AMPure XP は、87 µl (0.9x) | ||
=== PCR (約1.5時間) === | === PCR (約1.5時間) === | ||
2024年1月16日 (火) 16:35時点における版
目次 |
ポリA精製
- 10 ng - 1 µgのRNAを50µlにする
- NEBNext Oligo d(T)25 beads 20µl x サンプル数をエッペンに分注する。
- RNA Binding Buffer (2x) 100 µl x サンプル数を加え、ビーズを洗う。遠心して、ビーズを沈殿させ、磁性体スタンドに置く。上清を捨てビーズを回収する。2回行う。
- RNA Binding Buffer (2x) 50 µl x サンプル数を加え、懸濁する。
- 懸濁したビーズ50µlをRNAに加える。
- 65℃で5分間保温する。その後氷につけて冷やす。
- ビーズを懸濁しながら室温で5分間保温する。
- 遠心後、磁性体スタンドに置き、上清を捨てる。
- Wash Buffer 200µlを加え、懸濁する。スタンドに置いて上清を捨てる。2回行う。
- Tris Buffer 50µlを加え、懸濁する。
- 80℃で2分保温する。その後氷につけて冷やす。
- RNA Binding Buffer (2x) 50µlを加え、懸濁する。懸濁しながら室温で5分間温める。
- 遠心後、磁性体スタンドに置き、上清を捨てる。
- Wash Buffer 200µlを加え、懸濁する。スタンドに置いて上清を捨てる。
- First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X) 8 µl、NEBNext Random Primers 2 µlを加える。試薬はピンクの印
- * 訂正：「H2O 10 µl、First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X) 8 µl、NEBNext Random Primers 2 µl」x (サンプル数分) のmixを作製し、そのうちの10µlを加える。
- 94℃で10分間保温する。氷につけて室温に戻す。
- 遠心後、磁性体スタンドに置き、上清を新しいチューブに回収する。
cDNA合成
- NEBNext First Strand Synthesis Enzyme Mix 2 µl、水 8 µlを加える。試薬はピンクの印
- 25℃で10分、42℃で15分、70℃で15分保温する。
- NEBNext Second Strand Synthesis Reaction Buffer (10x) 8 µl、NEBNext Second Strand Synthesis Enzyme Mix 4 µl、水 48 µlを加える。試薬はオレンジの印
- 16℃で1時間保温する。
DNA精製
- AMPure XP 144 µl (1.8倍量)を加えて、よく撹拌して、5分間室温で放置する。
- 遠心後、磁性体スタンドに置き、上清を捨てる。
- 200 µl 80%エタノールを加え、30秒後、上清を捨てる。スタンドから外して混ぜたりする必要はない。2回行う。
- 遠心して上清を捨てたあと、5分間乾燥させる。
- 50.5 µl RSB (TruSeqのキットに付属)を加え、懸濁する。2分室温で放置する。
- 上清 50 µl を回収する。ここで止められる(-20℃)。
末端形成
- NEBNext Ultra II End Prep Reaction Buffer (10x) 7 µl、NEBNext Ultra II End Prep Enzyme Mix 3 µlを加える。試薬は緑の印
- * 補足：End Prep Enzyme Mix はキットの中で減りが速い、粘性が高いため、ピペットの目盛りを2 µlに合わせて吸う（と3 µl相当分が取れる）
- 20℃で30分間、65℃で30分間、保温する。
アダプター結合
- NEBNext AdaptorをAdapter Dilution Bufferで5倍に希釈する。最初のRNAが250ng未満のときはさらに5倍希釈する。100ng未満のときはさらに4倍希釈する。
- 希釈したAdaptor 2.5 µl、NEBNext Ligation Enhancer 1 µl、NEBNext Ultra II Ligation Master Mix 30 µlを加える。試薬は赤の印
- 20℃で15分間保温する。
- USER Enzyme 3 µlを加える。
- * 補足：End Prep Enzyme Mix 同様に粘性が高いため、ピペットの目盛りを2.5 µlに合わせて吸う
- 37℃で15分間保温する。
- AMPure XP 100 µl (等量)を加え、精製する。16 µl RSBを加え、15 µl 回収する。
- * 訂正：AMPure XP は、87 µl (0.9x)
PCR (約1.5時間)
- Index Primer 5 µl、Universal PCR Primer 5 µl 、NEBNext Ultra II Q5 Master Mix 25 µlを加える。
- 98℃で30秒、(98℃で10秒、65℃で75秒) x 8 cycle、65℃で5分、のPCRを行う。RNAが100ngのときはサイクル数を12に、10ngのときは15にする。
- AMPure XP 45 µl (0.9倍量)を加え、精製する。23 µl RSBを加え、21 µl 回収する。ここで止められる(-20℃)。
