ゲノム編集した植物のシークエンスの解析

（注意：編集中！）

CRISPR-Cas9でゲノム編集した植物のシークエンスを解析し、変異を同定する方法。

T2世代で変異アリルをもつものを選抜する （Cas9を持たないものを選抜。pKIベクターを用いた場合、OLE-RFPが光らない種子） （genotyping：PCR＋制限酵素処理で、切れないバンドを持つ個体を選抜） 上記のPCR産物を、PCRに用いたプライマー各々でキャピラリーシークエンスを行う。 この時に、シークエンスを解析し、変異を同定する方法。

1) 解析に使うファイルを準備する

• キャピラリーシークエンサーで読んだ波形ファイル（拡張子.ab1）
  • ゲノム編集した箇所をはさんだ領域をPCRで増幅したものを、両側のプライマーでシークエンス解析したファイル
• ゲノム編集した遺伝子のもとの配列とsgRNAの配列。FASTA形式で保存する

2) シーケンスアセンブリソフトウェア「ATGC」を起動

• 「ATGC」は共通PCにインストールしてあります

自分のPCで解析したい場合
インストール方法：中部大学総合情報センターから「Genetyx」をダウンロード・インストールして使用する http://www.isc.chubu.ac.jp/services/chubu/genetyx.html 上記ページへのアクセス、および「Genetyx」のダウンロード・インストールは中部大学内のネットワークへの接続が必要
起動方法：「ATGC」は遺伝情報処理ソフトウェア「Genetyx」内にあるので、以下のいずれかの方法で起動する (A) 「Genetyx」を起動し、ツールバーの「起動」-「ATGC」を選択 (B) 各自のPCの「C:ドライブ」-「Program Files」-「Genetyx_VerXX_Net」フォルダ内の「ATGC.exe」を起動 (A)の方法で起動する場合は、PCが中部大学内のネットワークに接続されている必要がある
初期設定：「ATGC」は初回使用時にパラメータを設定する必要がある（共通PCは設定済み） 「ファイル」-「環境設定」-「解析」を選択し 最小ホモロジースコア「30」 最小一致塩基数「10」 に変更する

3)・キャピラリーシークエンスのファイル（拡張子.ab1のファイル） 　・