MightyAmpを使ったPCR

PCRの原理

PCRは特定の塩基配列を持つDNAを増幅することができる方法で、分子生物学の実験においては最も重要な技術である。 PCRには(1)鋳型となるDNA、(2)プライマー、(3)耐熱性DNAポリメラーゼ、の3つが実験を成功させるために重要である。

試薬

• MightyAmp (Takara)
  • MightyAmp DNAポリメラーゼは酵素なので、-20℃で保存し、冷凍庫から取り出すときにはアイスボックスにいれておく。
  • PCRに使用する酵素は耐熱性なので熱には強いが、強い攪拌(かくはん)により活性が落ちることがあるので、酵素を入れたあとはボルテックスなどはしない。
• 10 µM プライマーストック
  • 合成したオリゴDNAは100µMもしくは50µMの濃度で届くことが多い。そのままでは希釈率が大きくなり扱いにくいので10µM程度に希釈したものをストックとして作っておくのがよい。
  • プライマーは特定の鋳型となるDNAとセットで使用することが多い。このとき、あるサンプルのDNAがプライマーに混入すると、それ以後の実験では混入したDNAから増幅されてしまう事故が起きる。購入したオリゴDNAがコンタミすると、買い直す必要が生じる。これを避けるためにも、購入したオリゴDNAを直接実験に用いないほうがよい。

手順

1. 0.2mlチューブ、もしくは8連チューブ、もしくは96ウェルプレートに以下のように混ぜ合わせる。
   • プライマーは2ついれることを忘れないように。

	50 µl	20 µl	10 µl
DNA	1 µl	1 µl	1 µl|
10 µM プライマー	2.5 µl	1 µl	0.5 µl|
MightyAmp	1 µl	0.4 µl	0.2 µl
2x Buffer	25 µl	10 µl	5 µl
合計	50 µl	20 µl	10 µl

1. 蓋をしてサーマルサイクラーにいれる。
2. 95℃ 3分(MightyAmpはHot Startなので必須)、98℃ 10秒 65℃ 15秒、68℃ 1分を40サイクルの条件でPCR反応を行う。温度と時間は目的とするものによって変わるので、ノートにきちんと記録すること。